Изучение возможностей применения методов газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием для определения некоторых противоопухолевых лекарственных средств в плазме крови

АННОТАЦИЯ

Разработаны методики количественного определения противоопухолевого препарата анастрозола в плазме крови человека. Разработанные методики были валидированы по показателям: селективность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения. Проведён сравнительный анализ методов и сделан вывод о преимуществе использования ВЭЖХ-МС при проведении исследований сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности препаратов анастрозола, а также терапев-тического лекарственного мониторинга.

Ключевые слова: анастрозол, плазма, ГХ-МС, ВЭЖХ-МС, валидация.

Онкологические заболевания второе место как причина смертности от инфекционных и неинфекционных заболеваний в мире (в т.ч. и в Российской Федерации) после сердечнососудистых заболеваний [1]. Учитывая актуальность проблемы фармакотерапии онкологических заболеваний, а также основываясь на основных положениях стратегии развития фармацевтической промышленности в Российской Федерации до 2020 года, утверждённой правительством РФ, которая предусматривает импортозамещение [2], ожидается рост числа разрабатываемых воспроизведённых протипоопухолевых препаратов с доказанной эффективностью и безопасностью, для которых встаёт вопрос об определении грамотного аналитического подхода для определения противоопухолевых препаратов в плазме крови человека с целью проведения исследований сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности, а также проведения терапевтического лекарственного мониторинга при фармакотерапии некоторыми препаратами. Для проведения исследования был выбран препарат анастрозол, включённый в российский перечень ЖНВЛП в 2012-2014 г. [3], являющийся оригинальной зарубежной разработкой, показавшей высокую эффективность в лечении рака молочной железы. В настоящее время в РФ зарегистрировано более 5 исследований биоэквивалентности для препаратов анастрозола, что делает актуальным данное исследование, целью которого является разработка и выбор оптимальной методики для количественного определения препарата в плазме крови [4].

Материалы и методы.

Для проведения исследования были исследования были выбраны методы газовой хроматографии с масс-селективным детектированием и высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием. Для проведения исследования были использованы газовый хроматограф Agilent и жидкостной хроматограф Waters Acquity, различные реактивы класса не ниже х.ч., вспомогательное оборудование, стандартный образец субстанции анастрозола.

Для разработки методики количественного определения анастрозола в плазме крови была приготовлена серия калибровочных растворов в диапазоне 25-500 нг/мл, что соответствует диапазону концентраций в плазме 5-100 нг/мл. Пробоподготовку исследуемых образцов плазмы крови (240 мкл чистой плазмы крови с прибавлением 60 мкл стандартного раствора анастрозола) проводили при помощи осаждения белков ацетонитрилом. Для этого к образцу плазмы прибавляли 900 мкл ацетонитрила, встряхивали на шейкере, центрифугировали, отбирали 1000 мкл надосадочной жидкости. Для проведения анализа методом газовой хроматографии пробы предварительно упаривали и перерастворяли сухой остаток в 100 мкл этилацетата.

Количественное определение анастрозола в плазме методом ВЭЖХ-МС проводили при помощи колонки Zorbax Eclipse Plus 150х4,6 мм, 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил и 10 ммоль раствор аммония формиата в воде. Объём вводимой пробы 10 мкл, время анализа 17 мин, время удерживания аналита около 14 мин. Детектирование проводили в режиме ES+ по иону с m/z = 293.

Количественное определение анастрозола в плазме методом ГХ-МС проводили при помощи кварцевой капиллярной колонки длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной фазы 0,25 мкм (100% диметилполисилоксан). В качестве подвижной фазы был использован гелий для газовой хроматографии. Объём вводимой пробы 1 мкл, время анализа 12 мин, время выхода аналита - 8 мин. Детектирование проводилось в SIM режиме по иону с m/z = 293.

Результаты и обсуждение.

Валидацию разработанных методик проводили согласно стандартным операционным процедурам лаборатории, подготовленным на основе руководств FDA, ЕМА и руководства по экспертизе ЛС под ред. А. Н. Миронова (том I) [5]. По результатам проведения валидации обе методики были признаны селективными. Для определения линейности были построены калибровочные графики в диапазоне концентраций 5-100 нг/мл. Коэффициенты корреляции r²= 0,997 (для ВЭЖХ-МС) и r²=0,993 (для ГХ-МС), что соответствует нормам (не менее 0,99). Для определения правильности и прецизионности пробы плазмы крови с концентрациями 5,0, 20,0, 100,0 нг/мл были проанализированы по 3 раза с помощью обоих методов на уровнях intra-day и inter-day, по результатам анализа были рассчитаны относительные стандартные отклонения и относительные погрешности для каждого уровня. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Относительные стандартные отклонения и относительные

погрешности для каждого уровня.

Полученные значения укладываются в норму (не более 20% для нижних точек диапазона линейности и не более 15% для остальных точек).

За предел количественного определения принята концентрация анастрозола, равная 5,0 нг/мл (на основании данных о правильности и прецизионности).

По результатам статистической обработки с использованием расчёта критерия Фишера по результатам двух выборок для концентраций анастрозола на уровнях концентраций 5 нг/мл (intraday), 20 нг/мл (intra-day), 20 нг/мл (inter-day), 100 нг/мл (inter-day) показаны статистически значимые различия двух дисперсий (при P > 0,05), при этом уровень вариабельности для метода ГХ-МС является более высоким (RSD5intra=18,52, RSD20intra=14,26, RSD20inter =11,77,

RSD100inter =9,49). Исходя из этих данных, был сделан вывод, что при проведении исследований биоэквивалентности и сравнительной фармакокинетики предпочтительнее использовать метод ВЭЖХ с масс-селективным детектированием, поскольку данный метод обладает более высокими правильностью и прецизионностью и является более пригодным для анализа.

Выводы.

По результатам проведения сравнительного исследования валидационных характеристик разработанных методик количественного определения анастрозола в плазме крови были сделаны выводы о предпочтительности использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором.

ЛИТЕРАТУРА

1. URL: http://www.who.int/gho/en/ (дата обращения: 24.07.2013)
2. Постановление Правительства РФ от 17.02.2011 №91 «О федеральной целевой программе «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».
3. Распоряжение правительства РФ РФ №2427 от 19.12.2013 г "Об утверждении списка жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов на 2014 г".
4. Ю.В. Медведев, Г. В. Раменская, И.Е. Шохин, Т.А. Ярушок. ВЭЖХ и СВЭЖХ как методы для определения лекарственных веществ в крови (обзор) /Химико-фармацевтический журнал. 2013. 4. 45-51.
5. Руководство по экспертизе лекарственных средств под ред. проф. А. Н. Миронова. Том I. / М.: Гриф и К, 2013.