Аннотация
Наиболее распространенным методом идентификации и количественного определения флавоноидов в настоящее время является хроматографические методы такие как ТСХ, ВЭЖХ. Гармонизация национальной системы обеспечения качества лекарственных средств с европейскими требованиями поднимает на высокий уровень аналитический контроль качества. Для объективной оценки аналитических методик служит проведение валидационной процедуры. Результаты проведенных валидационных исследований характеризуют степень точности и воспроизводимости метода, а также позволяют оценить погрешность методики. Научная работа посвящена проведению валидации аналитической методики определения подлинности таблеток с экстрактом шлемника байкальского сухого методом тонкослойной хроматографии и количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин методом спекторофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях.
Ключевые слова: валидация, аналитические методики, байкалин, тонкослойная хроматография.
Одним из перспективных источников фитопрепаратов считаются лекарственные растения, содержащие флавоноиды, которые в силу широкого распространения в растениях и большого структурного разнообразия в настоящее время находятся в центре внимания исследователей в области фармакогнозии, фармации и медицины [1-3].
Наиболее распространенным методом идентификации и количественного определения флавоноидов в настоящее время являются хроматографические и спектральные методы анализа.
Материалы и методы.
Предложено проводить стандартизацию препарата с использованием тонкослойной хроматографии, для теста идентификации, и спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях для идентификации и определения количественного содержания.
Экспериментальная часть.
В соответствии с ГФУ и Руководством CPMP/ICH/381/95 для аналитической методики идентификации необходимо определять ее специфичность. Специфичность методики ТСХ определяется тем, что Rf пятна байкалина полученного на хроматограмме испытуемого раствора совпадает с Rf пятна байкалина полученного на хроматограмме рассчитанного по хроматограмме раствора СО байкалина и составляет около 0,5, а так же тем, что на хроматограмме раствора плацебо отсутствуют пятна с коэффициентом Rf соответствующим коэффициенту Rf байкалина на хроматограмме раствора СО байкалина.
Для аналитической методики идентификации методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях была определена ее специфичность, а для методики количественного определения так же правильность, прецизионность, линейность и диапазон применения. Для прогнозирования воспроизводимости методики, так же проведен расчет полной неопределенности методики.
Специфичность методики определяется тем, что на УФ-спектре поглощения раствора плацебо, записанного в области от 230 нм до 400 нм, поглощение в области определяемых максимумов поглощения не должно превышать максимально допустимого значения для систематической погрешности (не более 1,02 % от поглощения раствора в максимуме). Так же на УФ-спектрах поглощения раствора препарата и раствора стандартного образца байкалина максимумы поглощения должны совпадать с точностью до ± 2 нм и находится в области 279±2 нм и 320±2 нм.
Таблица 1 - Результаты анализа растворов модельных смесей, содержащих от 80 % до 120 % байкалина, и их статистическая обработка
|
№ Р-Ра |
Введено в % от номинального содержания (Xi, факт., %) |
Найдено в % от номинального содержания (Yi, %) |
Найдено в % к введенному Zi = 100 □ (Yi/Xi) |
|
1 |
80,17 |
80,62 |
100,56 |
|
2 |
85,33 |
85,66 |
100,39 |
|
3 |
89,83 |
89,34 |
99,45 |
|
4 |
95,33 |
94,57 |
99,20 |
|
5 |
100,67 |
100,19 |
99,52 |
|
6 |
104,83 |
105,23 |
100,38 |
|
7 |
109,67 |
108,91 |
99,31 |
|
8 |
115,17 |
114,53 |
99,44 |
|
9 |
120,33 |
119,96 |
99,69 |
|
Среднее, Zcp, % = |
99,77 |
||
|
Относительное стандартное отклонение, RSDz, % |
0,5231 |
||
|
Относительный доверительный интервал, А, % |
0,9727 |
||
|
Критическое значение для сходимости результатов □ As □ %= |
3,2 |
||
|
Систематическая погрешность □ = \ ZCp -1001 |
0,23 |
||
|
Критерий незначимости систематической ошибки 1) статистическая незначимость: 8 < Az : ^9 =0,97/3= 0,32 % > 0,23 % Если не выполняется 1), то: 2) практическая незначимость: 5,% < 0,32 х 3,2 = 1,02 % > 0,23% |
Выполняется Выполняется |
||
|
Общий вывод о методике |
КОРРЕКТНА |
||
Из рис.1 видно, что максимумы поглощения на УФ спектрах препарата и раствора стандартного образца байкалина совпадают, а величина поглощения раствора плацебо составляет соответственно 0,46 % раствора СО байкалина и 0,47 % для раствора препарата, что соответствует установленным требованиям.
Закладку экстракта шлемника байкальского сухого в препарат проводят в пересчете на 30 % содержание байкалина, таким образом номинальное содержание его в таблетке составляет 15 мг. При В=10% пределы содержания составляют от 13,5 мкг до 16,5 мкг в одной таблетке. Согласно методике из количества порошка соответствующего 1 таблетке извлекают определяемое вещество и разводят в 2500 раз. Соответственно рабочая концентрация составляет около 12 мкг/мл.
Исследования валидационных характеристик: правильность, прецизионность и линейность проводили методом введено/найдено в диапазоне концентраций байкалина от 80 % до 120 % от номинального, т.е. от 12 мг до 17 мг в одной таблетке или от 9,6 мкг/мл до 14,4 мкг/мл для концентраций растворов модельных смесей.
Расчет содержания проводили с использованием удельного показателя поглощения байкалина, который равен 600.
В табл. 1 приведены расчеты основных валидационных параметров характеризующих правильность и прецизионность аналитической методики.
Полученное значение доверительного интервала величины Z (0,5231 %) меньше критического значения для сходимости результатов (3,2 %), что указывает на хорошую сходимость получаемых результатов.
Значение систематической ошибки -0,23 % удовлетворяет требованиям статистической и практической незначимости, что характеризует правильность методики.
Исследование линейной зависимости Y=A+BX, где Х-введенное количество определяемого вещества, Y- найденное количество определяемого вещества, проводили в диапазоне концентраций от 80 % до 120 % по отношению к номинальному значению. В табл. 2 приведены рассчитанные параметры линейной зависимости отношения введено/найдено.
Линейность зависимости между взятым и найденным количеством байкалина подтверждается соответствием требованиям критерия приемлемости для коэффициента корреляции r = 0,99236, который равен r = 0,99947.
Таблица 2 - Характеристики линейной зависимости найденной концентрации байкалина от его введенной конценрации
|
Параметры |
Значения |
Требования 1 |
Требования 2 |
Заключение |
|
B |
0,98136 |
|||
|
Sb |
0,01208 |
|||
|
A |
1,60945 |
□ □ |1,895х A|=1,58 |
□ |5,2 I |
Выполняются |
|
Sa |
1,21969 |
|||
|
RSDo |
0,46693 |
|||
|
r |
0,99947 |
>|0,99236| |
Выполняются |
Таким образом, предложенная методика удовлетворяет требованиям к таким валидационным характеристикам, как правильность, прецизионность и линейность во всем диапазоне концентраций байкалина от 80 % до 120 % от номинального значения.
Таблица 3 - Данные для расчета неопределенности пробоподготовки для методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин
|
Операция пробоподготовки |
Параметр расчетной формулы |
Неопределенност ь, (А), % |
|
Испытуемый раствор |
||
|
1. Взятие навески препарата, m |
m = 210 мг |
0,09 % |
|
2. Доведение до объема в мерной колбе 100 мл |
100 |
0,12 % |
|
3. Отбор аликвоты 2 мл |
2 |
0,5 % |
|
4. Доведение до объема в мерной колбе 25 мл |
25 |
0,23 % |
Как указано выше, для прогнозирования воспроизводимости методики при повторных испытаниях или в других лабораториях проведен прогноз полной неопределенности методики (JAs): Л^ = д/ Л2Р + Л^о , где JsP- неопределенность пробоподготовки, Jfao неопределенность конечной аналитической операции.
При этом полная неопределенность результатов анализа не должна превышать максимально допустимую неопределенность результатов анализа для допусков содержания: ±10 % - max AAs < 3,2 %.
Суммарная неопределенность пробоподготовки для препарата рассчитана согласно операций приведенных в таблице 3 Asp равна:
3SF,% =у/0,092 + 0,122 + 0,52 + 0,232 = 0,57
Неопределенность конечной аналитической операции измерения расчитан из относительного стандартного отклонения (RsD, %) для полученных результатов и составила 0,15%. Соответственно величина полной неопределенности методики определения байкалина составляет, 0,59%, что не превышает критического значения 3,2%:
ВЫВОДЫ
Представленные результаты показывают, что методика количественного определения байкалина в диапазоне применения методики соответствует критериям приемлемости для валидационных характеристик: специфичность, правильность, прецизионность (сходимость) и линейность. Полная прогнозируемая неопределенность результатов анализов не превышает критическое значение.
ЛИТЕРАТУРА
- Wang, H., Cao, J., Xu, S., Gu, D., Wang, Y., Xiao, S. Depletion of high-abundance flavonoids by metal complexation and identification of low-abundance flavonoids in Scutellariabaicalensis Georgi //Journal of Chromatography A.- 2013.-V. 1315, № 8 November.- P. 107-117.
- Zhu, H., Wang, Z., Xing, Y., Gao, Y., Ma, T., Lou, L., Lou, J., Wang, Y.Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells//Journal of Ethnopharmacology.-2012.- № 141 (2), pp. 714-720.
- Islam, M.N., Chung, H.J., Kim, D.-H., Yoo, H.H.A Simple isocratic HPLC method for the simultaneous determination of bioactive components of Scutellariae Radix extract\\ Natural Product Research.-2012.-V.26, № Issue 21.-P.1957-1962.