Валидация аналитической методики определения подлинности таблеток с экстрактом шлемника байкальского сухого методом тонкослойной хроматографии

Аннотация

Наиболее распространенным методом идентификации и количественного определения флавоноидов в настоящее время является хроматографические методы такие как ТСХ, ВЭЖХ. Гармонизация национальной системы обеспечения качества лекарственных средств с европейскими требованиями поднимает на высокий уровень аналитический контроль качества. Для объективной оценки аналитических методик служит проведение валидационной процедуры. Результаты проведенных валидационных исследований характеризуют степень точности и воспроизводимости метода, а также позволяют оценить погрешность методики. Научная работа посвящена проведению валидации аналитической методики определения подлинности таблеток с экстрактом шлемника байкальского сухого методом тонкослойной хроматографии и количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин методом спекторофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях.

Ключевые слова: валидация, аналитические методики, байкалин, тонкослойная хроматография.

Одним из перспективных источников фитопрепаратов считаются лекарственные растения, содержащие флавоноиды, которые в силу широкого распространения в растениях и большого структурного разнообразия в настоящее время находятся в центре внимания исследователей в области фармакогнозии, фармации и медицины [1-3].

Наиболее распространенным методом идентификации и количественного определения флавоноидов в настоящее время являются хроматографические и спектральные методы анализа.

Материалы и методы.

Предложено проводить стандартизацию препарата с использованием тонкослойной хроматографии, для теста идентификации, и спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях для идентификации и определения количественного содержания.

Экспериментальная часть.

В соответствии с ГФУ и Руководством CPMP/ICH/381/95 для аналитической методики идентификации необходимо определять ее специфичность. Специфичность методики ТСХ определяется тем, что Rf пятна байкалина полученного на хроматограмме испытуемого раствора совпадает с Rf пятна байкалина полученного на хроматограмме рассчитанного по хроматограмме раствора СО байкалина и составляет около 0,5, а так же тем, что на хроматограмме раствора плацебо отсутствуют пятна с коэффициентом Rf соответствующим коэффициенту Rf байкалина на хроматограмме раствора СО байкалина.

Для аналитической методики идентификации методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях была определена ее специфичность, а для методики количественного определения так же правильность, прецизионность, линейность и диапазон применения. Для прогнозирования воспроизводимости методики, так же проведен расчет полной неопределенности методики.

Специфичность методики определяется тем, что на УФ-спектре поглощения раствора плацебо, записанного в области от 230 нм до 400 нм, поглощение в области определяемых максимумов поглощения не должно превышать максимально допустимого значения для систематической погрешности (не более 1,02 % от поглощения раствора в максимуме). Так же на УФ-спектрах поглощения раствора препарата и раствора стандартного образца байкалина максимумы поглощения должны совпадать с точностью до ± 2 нм и находится в области 279±2 нм и 320±2 нм.

Таблица 1 - Результаты анализа растворов модельных смесей, содержащих от 80 % до 120 % байкалина, и их статистическая обработка

Р-Ра

Введено в % от номинального содержания (Xi, факт., %)

Найдено в % от номинального содержания (Yi, %)

Найдено в % к введенному Zi = 100 □ (Yi/Xi)

1

80,17

80,62

100,56

2

85,33

85,66

100,39

3

89,83

89,34

99,45

4

95,33

94,57

99,20

5

100,67

100,19

99,52

6

104,83

105,23

100,38

7

109,67

108,91

99,31

8

115,17

114,53

99,44

9

120,33

119,96

99,69

Среднее, Zcp, % =

99,77

Относительное стандартное отклонение, RSDz, %

0,5231

Относительный доверительный интервал, А, %

0,9727

Критическое значение для сходимости результатов  As □ %=

3,2

Систематическая погрешность □ = \ ZCp -1001

0,23

Критерий незначимости систематической ошибки

1) статистическая незначимость: 8 < Az : ^9 =0,97/3= 0,32 % > 0,23 %

Если не выполняется 1), то:

2) практическая незначимость: 5,% < 0,32 х 3,2 = 1,02 % > 0,23%

Выполняется

Выполняется

Общий вывод о методике

КОРРЕКТНА

Из рис.1 видно, что максимумы поглощения на УФ спектрах препарата и раствора стандартного образца байкалина совпадают, а величина поглощения раствора плацебо составляет соответственно 0,46 % раствора СО байкалина и 0,47 % для раствора препарата, что соответствует установленным требованиям.

Закладку экстракта шлемника байкальского сухого в препарат проводят в пересчете на 30 % содержание байкалина, таким образом номинальное содержание его в таблетке составляет 15 мг. При В=10% пределы содержания составляют от 13,5 мкг до 16,5 мкг в одной таблетке. Согласно методике из количества порошка соответствующего 1 таблетке извлекают определяемое вещество и разводят в 2500 раз. Соответственно рабочая концентрация составляет около 12 мкг/мл.

Исследования валидационных характеристик: правильность, прецизионность и линейность проводили методом введено/найдено в диапазоне концентраций байкалина от 80 % до 120 % от номинального, т.е. от 12 мг до 17 мг в одной таблетке или от 9,6 мкг/мл до 14,4 мкг/мл для концентраций растворов модельных смесей.

Расчет содержания проводили с использованием удельного показателя поглощения байкалина, который равен 600.

В табл. 1 приведены расчеты основных валидационных параметров характеризующих правильность и прецизионность аналитической методики.

Полученное значение доверительного интервала величины Z (0,5231 %) меньше критического значения для сходимости результатов (3,2 %), что указывает на хорошую сходимость получаемых результатов.

Значение систематической ошибки -0,23 % удовлетворяет требованиям статистической и практической незначимости, что характеризует правильность методики.

Исследование линейной зависимости Y=A+BX, где Х-введенное количество определяемого вещества, Y- найденное количество определяемого вещества, проводили в диапазоне концентраций от 80 % до 120 % по отношению к номинальному значению. В табл. 2 приведены рассчитанные параметры линейной зависимости отношения введено/найдено.

Линейность зависимости между взятым и найденным количеством байкалина подтверждается соответствием требованиям критерия приемлемости для коэффициента корреляции r = 0,99236, который равен r = 0,99947.

Таблица 2 - Характеристики линейной зависимости найденной концентрации байкалина от его введенной конценрации

Параметры

Значения

Требования 1

Требования 2

Заключение

B

0,98136

     

Sb

0,01208

     

A

1,60945

□ □ |1,895х A|=1,58

□ |5,2 I

Выполняются

Sa

1,21969

     

RSDo

0,46693

     

r

0,99947

>|0,99236|

 

Выполняются

Таким образом, предложенная методика удовлетворяет требованиям к таким валидационным характеристикам, как правильность, прецизионность и линейность во всем диапазоне концентраций байкалина от 80 % до 120 % от номинального значения.

Таблица 3 - Данные для расчета неопределенности пробоподготовки для методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин

Операция пробоподготовки

Параметр расчетной формулы

Неопределенност ь, (А), %

Испытуемый раствор

1. Взятие навески препарата, m

m = 210 мг

0,09 %

2. Доведение до объема в мерной колбе 100 мл

100

0,12 %

3. Отбор аликвоты 2 мл

2

0,5 %

4. Доведение до объема в мерной колбе 25 мл

25

0,23 %

Как указано выше, для прогнозирования воспроизводимости методики при повторных испытаниях или в других лабораториях проведен прогноз полной неопределенности методики (JAs): Л^ = д/ Л2Р + Л^о , где JsP- неопределенность пробоподготовки, Jfao неопределенность конечной аналитической операции.

При этом полная неопределенность результатов анализа не должна превышать максимально допустимую неопределенность результатов анализа для допусков содержания: ±10 % - max AAs < 3,2 %.

Суммарная неопределенность пробоподготовки для препарата рассчитана согласно операций приведенных в таблице 3 Asp равна:

3SF,% =у/0,092 + 0,122 + 0,52 + 0,232 = 0,57

Неопределенность конечной аналитической операции измерения расчитан из относительного стандартного отклонения (RsD, %) для полученных результатов и составила 0,15%. Соответственно величина полной неопределенности методики определения байкалина составляет, 0,59%, что не превышает критического значения 3,2%:

ВЫВОДЫ

Представленные результаты показывают, что методика количественного определения байкалина в диапазоне применения методики соответствует критериям приемлемости для валидационных характеристик: специфичность, правильность, прецизионность (сходимость) и линейность. Полная прогнозируемая неопределенность результатов анализов не превышает критическое значение.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Wang, H., Cao, J., Xu, S., Gu, D., Wang, Y., Xiao, S. Depletion of high-abundance flavonoids by metal complexation and identification of low-abundance flavonoids in Scutellariabaicalensis Georgi //Journal of Chromatography A.- 2013.-V. 1315, № 8 November.- P. 107-117.
  2. Zhu, H., Wang, Z., Xing, Y., Gao, Y., Ma, T., Lou, L., Lou, J., Wang, Y.Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells//Journal of Ethnopharmacology.-2012.- № 141 (2), pp. 714-720.
  3. Islam, M.N., Chung, H.J., Kim, D.-H., Yoo, H.H.A Simple isocratic HPLC method for the simultaneous determination of bioactive components of Scutellariae Radix extract\\ Natural Product Research.-2012.-V.26, № Issue 21.-P.1957-1962.
Год: 2014
Город: Шымкент
Категория: Медицина