Количественное содержание изофлавоноидов в сухом эксракте клевера лугового

АННОТАЦИЯ

В статье представлены данные количественного определения изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового методом прямой спектрофотометрии в пересчете на формононетин.

Ключевые слова: клевер луговой, сухой экстракт, изофлавоноиды, спектрофотометрия, формононетин.

В настоящее время все большее внимание исследователей привлекают вещества группы флавоноидов и изофлавоноидов. Эти соединения обладают высокой биологической активностью и, что особенно ценно, низкой токсичностью. Препараты, созданные на их основе являются высокоэффективными противоопухолевыми средствами, обладают антиоксидантными свойствами, снижают риск заболеваний сердечно-сосудистой системы [1].

За последние двадцать лет число известных изофлавонов пополнилось на 230 новых соединений. Среди них большое разнообразие структур с различными заместителями и биологическими свойствами. В большинстве своем эти вещества были обнаружены у представителей семейства бобовых (Fabaceae), среди которых объектами наиболее интенсивного исследования оказались растения рода клевер (Trifolium L.). Это связано, прежде всего, с их практически повсеместным распространением, массовым произрастанием и популярностью в народной медицине.

Имеется большое количество данных по биологической активности изофлавоноидов клевера. В практике разведения рогатого скота давно известен факт, когда обильное поедание животными клевера приводит к их фертильности. Вполне закономерно, что такие свойства клевера не могли не привлечь внимания исследователей. S.M.Bouea с соавторами, экспериментально установили высокую эстрогенную активность экстрактов клевера лугового, которая была обусловлена изофлавонами даидзеином, генистеином, также их глюкозидами - даидзином и генистином [2].

Ch. Atkinson с соавторами показали высокую биологическую активность препарата, созданного на основе четырех изофлавонов: формононетина, биоханина-А, генистеина и даидзеина. Они испытали лекарственное средство на больных раком молочной железы и обнаружили прекращение роста опухоли у женщин, принимавших этот препарат. Причем никаких побочных действий отмечено не было. Этими же авторами установлены антилейкемические и протекторные свойства изофлавоноидов клевера лугового по отношению к сердечно-сосудистой системе [3].

В литературе приводятся экспериментальные данные, согласно которым изофлавоноиды клевера лугового снижают симптомы менопаузы в климактерический период, оказывают позитивное влияние на уровень триглициридов, холестерина, увеличивают синтез простациклина, тестостерона в плазме, предотвращают возникновение рака молочной железы. Изофлавоны надземной части клевера лугового обладают также гипохолестеринемическими, антиатеросклеротическими свойствами, экстракт из надземной части оказывает гиполипидемическое действие [4].

За рубежом на основе клевера лугового получен ряд биологически активных добавок для профилактики и вспомогательного лечения атеросклероза, заболеваний сердечно-сосудистой системы, печени, желчного пузыря, поддержания иммунной системы и др. [5].

Для сухого экстракта клевера лугового была показана высокая антиоксидантная активность. В своих исследованиях бразильские ученые использовали хемилюменисцентный метод для установления антиоксидантных свойств экстрактов различных растений, смесей изофлавоноидов, а также чистых образцов флавоноидов, в частности - кверцетина, известного своими антиоксидантными свойствами и широко применяемого во всем мире. Они показали, что экстракт клевера обладает более высокой антиоксидантной активностью по сравнению со всеми остальными объектами их исследования, в том числе он более активен, чем мощный антиоксидант кверцетин [6].

Как видно из приведенных данных, спектр биологических свойств изофлавоноидов клевера достаточно широк, что, вместе с их очень низкой токсичностью, делает эти соединения перспективными для использования в лечебных целях. Общий недостаток перечисленных лекарственных средств и их существующих аналогов в том, что их главными действующими началами являются общие спиртовые экстракты, химический состав которых изучен недостаточно, а действующие вещества - не выявлены. В связи с этим научный интерес представляет изучение сухого экстракта из травы клевера лугового, произрастающего в Узбекистане на содержание изофлавоноидов для его стандартизации и создания новых эффективных лекарственных средств на его основе с последующим внедрением в медицинскую практику. Нами разработана методика качественного и количественного определения изофлавоноидов в траве клевера лугового [7].

Целью настоящей работы является количественное определение изофлавоноидов в сухом экстракте, полученного из надземной части клевера лугового, позволяющих быстро и объективно оценить качество сухого экстракта.

Экспериментальная часть. Объектом исследования служили образцы водно-спиртового сухого экстракта клевера лугового, полученного в Ташкентском фармацевтическом институте на кафедре фармакогнозии. Сухой экстракт клевера лугового по физико-химическим свойствам является сыпучим порошком, представляет собой от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, слабого своеобразного запаха, горького вкуса.

Методика количественного определения изофлавоноид в сухом экстракте клевера лугового. Для количественного определения изофлавоноидов использовали метод прямой спектрофотометрии. Для этого были изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений сухого экстракта клевера лугового. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Agilent 8453». Основной максимум поглощения извлечения из исследуемого препарата отмечен при длине волны 260±5 нм. С ним практически полностью совпадал максимум поглощения раствора РСО формононетина (рис.1). Отмеченное обстоятельство указывает на возможность использования формононетина в качестве стандарта при количественном определении изофлавоноидов в исследуемом объекте.

Около 1 г (точная навеска) сухого экстракта помещали в коническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, прибавляли 30 мл 60% спирта этилового. Затем колбу соединяли с обратным холодильником и нагревали содержимое колбы на кипящей водяной бане при температуре 100⁰С в течение 45 мин. После охлаждения до комнатной температуры извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли дважды в описанных выше условиях, фильтровали в ту же мерную колбу. Затем объем извлечения доводили 60% спиртом этиловым до метки и перемешивали (раствор А).

Рисунок 1 - Спектр поглощения раствора водно-спиртового извлечения из сухого экстракта клевера лугового

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 1 мл раствора А и доводили объем 60% этиловым спиртом до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 260±0,5 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения 60% спирт этиловый. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца формононетина.

Содержание изофлавоноидов в пересчете на формононетин в сухом экстракте в процентах

где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D_o - оптическая плотность раствора РСО формононетина; m - масса сухого экстракта, в граммах; то - масса РСО формононетина, в граммах; W - потеря в массе при высушивании сухого экстракта, в процентах.

Приготовление раствора стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) РСО формононетина, предварительно высушенного до постоянной массы при 105^оС в течение 3 ч, растворяли в 25 мл спирта метилового в мерной колбе вместимостью 50 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали, затем доводили объем раствора до метки тем же спиртом и перемешивали (раствор С). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 0,6 мл раствора С, доводили объем 95% спиртом этиловым до метки и перемешивали.

Методика была апробирована с целью изучения ее воспроизводимости и точности. Ошибка единичного определения изофлавоноидов при доверительной вероятности 95% составляет ±3,318 % (табл.1).

Таблица 1- Метрологические характеристики методики количественного определения изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового

С помощью методики количественного определения изофлавоноидов в пересчете на формононетин было определено его содержание в пяти сериях сухого экстракта клевера лугового (табл.2).

Таблица 2 -Содержание суммы изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового

Установлено, что содержание изофлавоноидов в сухом экстракте колеблется от 10,17 до 10,50%.

Исходя из полученных данных, нами установлена норма количественного содержания изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового в пересчете на формононетин должно быть не менее 10%.

ВЫВОДЫ

1. На основании полученных результатов количественного определения установлены нормы содержания изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового методом прямой спектрофотометрии. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 95 % не превышает 5,0 %.
2. Содержание изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового колеблется от 10,17 до 10,50%.
3. Количественного содержания изофлавоноидов в сухом экстракте клевера лугового в пересчете на формононетин установлена не менее 10%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Middleton E., Kandaswami C., Theoharis C.T. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer // Pharmacol. Rev. - 2000. - Vol. 52. P. 653-751.
2. Bouea S.M., Wiese Th.E., Nehls S., Burow M.E., Elliott S., Carter-Wientjes C.H., Shih B.Y., Mclachlan Jh.A., Cleveland Th.E. Evaluation of the Estrogenic Effects of Legume Extracts Containing Phytoestrogens // J. Agric. Food Chem. - 2003. - Vol.51. - P. 2193-2199.
3. Atkinson Ch., Oosthuizen W., Scollen S., Loktionov A., Day N.E., Bingham Sh. A. Modest Protective Effects of Lsoflavones from a Red Clover-Derived Dietary Supplement on Cardiovascular Desease Risk Factors in Perimanopausal Women, and Evidence of an Interaction with ApoE Genotype in 49-65 Year-Old Women // Human Nutrition and Metabolism. - Vol.134, - 2004. - P.1759-1764.
4. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т.3. семейства Fabaceae - Apiaceae // Под ред. А.Л. Буданцева. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010. - 601с.
5. Халилова Ш.Р., Урманова Ф.Ф. Стандартизация травы клевера лугового, произрастающего в Узбекистане // Фармацевтический журнал. - Ташкент, 2013. - №4. - С.33-38.
6. Georgetti S. R., Casagrande R., Di Mambro V. M., Azzolini A. ECS., Fonseca M. JV. Evaluation of the Antioxidant Activity of Different Flavonoids by the Chemiluminescense Method // AAPS FarmSci. - Vol. 5, Iss. 2. - 2003. Article 20.
7. Khalilova Sh.R., Yuldashev M.P., Urmanova F.F. Procedure for determination of isoflavonoids in overground part of meadow clover growing in Uzbekistan // Украінський медичний альманах. - Луганськ, 2014. - Т.17. - №1. - С.4-7.