Оценка спектра мутаций в генах днк m.tuberculosi у больных туберкулезом с лекарственной устойчивостью

АННОТАЦИЯ

В работе отражены результаты оценки профиля лекарственной устойчивости методами: ДНК-секвенированием и MIRU-VNTR анализом ДНК M. tuberculosis, выделенных от больных с МЛУ/ШЛУТБ. По результатам ДНК-секвенирования найдены конкретные мутации при резистетности к рифампицину и изониазиду. Интерес представляло обнаружение в 30% случаев двойных мутаций, что говорит о возможности формирования хронически устойчивого туберкулеза. В результате лабораторной апробации генов embB, rpsL, rrs и pncA, gyrA, tlyA, t500UmycbR, обуславливающих устойчивость к препаратам 2 ряда были подобраны праймеры и отработаны оптимальные условия ПЦР. По результатам исследований определено 24 различных генотипа, из которых 19 (32,6%) были уникальными.

Ключевые слова: туберкулез, микобактерии, лекарственная устойчивость,

диагностика, генетика, мутации, секвенирование

В Казахстане внедрены новейшие молекулярно-генетические экспресс методы диагностики М/ШЛУТБ во всех областных противотуберкулезных учреждениях. Однако, фундаментальные молекулярно-генетические исследования на уровне генома микобактерий позволяют выявить больший их спектр, связанный с МЛУ/ШЛУТБ. Это объясняется тем, что в тест- системах «заложены» не все варианты мутаций, а в ДНК МБТ, как известно, постоянно происходят мутации [1]. Поэтому целью данного исследования была оценка спектра мутаций ДНК M. tuberculosis , выделенных от больных МЛУ/ШЛУТБ ДНК-секвенированием и MIRU-VNTR анализом.

Материалы и методы

Исследованы 40 образцов ДНК культур M. tuberculosis от больных лекарственноустойчивым туберкулезом легких. Инфильтративная и фиброзно-кавернозные формы туберкулеза были обнаружены в 77,5% и 22,5% случаев. По данным теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ), 24 (60%) клинических штамма M. tuberculosis были идентифицированы как мультирезистентные и 16 (40%) - как ШЛУ штаммы.

Амплификацию фрагментов генома клинических штаммов M. Tuberculosis проводили в амплификаторе DNA Engine Tetrad BioRad. Визуализацию продуктов амплификации осуществляли путем электрофореза в 1,5 % агарозном геле с

последующей окраской бромистым этидием. Образцы, для проведения реакций секвенирования, дополнительно обрабатывали экзонуклеазой I E. coli (ExoI, Fermentas, Литва), добавляя к вышеописанной реакционной смеси 5 ед. ExoI. Определение нуклеотидных последовательностей локусов генома проводили с использованием ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI 3730 (Applied Biosystems, США) Genetic Analyzer.

MIRU-VNTR генотипирование основывалось на анализе числа тандемных повторов в 24 локусах генома штаммов M. tuberculosis. В работе были использованы известные последовательности праймеров 24 MIRU локусов из базы данных http://www.miru- vntrplus.org/MIRU/).

Число тандемных повторов в соответствующем локусе вычислялось исходя из размера ПЦР-продукта, определяемого путем сравнения размера полученного фрагмента с 100 п.о. маркером молекулярного веса ДНК - GeneRuler™ 100 bp DNA Ladders (Fermentas), с использованием программного пакета Quantity One v.4.4.0 (BioRad).

Результаты и обсуждение

Нами проведена оценка спектра мутаций в генах-мишенях M.tuberculosis, ассоциированных с устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам рифампицину и изониазиду (МЛУТБ) и препаратам второго ряда (ШЛУТБ) и соответственно изучены гены резистентности : гроВ и katG, промоторной области fabG- inhA и embB, rpsL, rrs и pncA, gyrA, tlyA, t500UMycbR.

По результатам ДНК-секвенирования 40 клинических изолятов M.tuberculosis, циркулирующих в Казахстане, выделенных как от впервые выявленных больных, так и от больных с повторным случаем заболевания, были найдены мутации в “hot region” rpoB гена в 531 кодоне у 33(82,5%) изолятов при замене серина на лейцин (TCG^-TTG); также были определены мутации в 526 кодоне, где обнаружено 5 вариантов мутаций [2].

В одном случае (2,5%) отмечена мутация в промоторной области fabG-inhA оперона в позиции 15С’^Т и 8T^C каждый. В остальных случаях были обнаружены двойные мутации в гене katG в 315 кодоне, замена серина на треонин (AGC^ACC) и промоторной области fabG-inhA у 6(15%) изолятов в позиции -15(С^Т) и у 4(10%) изолятов в позиции -8(Т^С), обуславливающие устойчивость к изоназиду. Наличие двойных мутаций говорит о возможности формирования хронически устойчивого туберкулеза у обследованных больных.

Амплифицированы и определены нуклеотидные последовательности гена embB 15 клинических изолятов M.tuberculosis, которые фенотипически были устойчивы к этамбутолу.В результате выполненной работы определены нуклеотидные последовательности embB гена всех клинических изолятов M.tuberculosis и было выявлено 2 различных варианта мутаций в кодоне Met306. Это объяснимо тем, что у 60% штаммов МБТ, резистентных к этамбутолу, наблюдается изменение в аминокислотном составе в положении 306 гена embB, а примерно у 25% этамбутол- резистентных штаммов не известны механизмы формирования устойчивости.

В результате лабораторной апробации генов embB, rpsL, rrs и pncA, gyrA, tlyA, t500UmycbR, обуславливающих устойчивость к препаратам второго ряда, были подобраны праймеры и отработаны оптимальные условия для проведения ПЦР.

По результатам исследований определено 24 различных генотипа, из которых 19 (32,6%) были уникальными, оставшиеся 21 (67,4%) изолятов M. tuberculosis входили в 5 кластеров.

Сравнение MIRU-VNTR-профилей, полученных в данном исследовании, с теми, которые доступны через международную базу данных http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/ показало, что преобладающая группа изолятов (n=39, 97,5%) принадлежит семейству W- Beijing и 1 изолят (2,5%) - к генетическому семейству LAM. Два кластера составили по 6 групп пациентов, в другие кластеры вошли от 2 до 5 пациентов каждый. Все кластеры принадлежат к семейству W-Beijing, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.

Выводы

  1. Результаты ДНК-секвенирования M.tuberculosis, циркулирующих в Казахстане свидетельствуют о мутациях в “hot region” rpoB гена в 531 и 526 кодонах. В 70% они установлены в 315 кодоне гена katG и в 2,5% - в промоторной области fabG-inhA. В оставшихся 6 (15%) случаях имели место двойные мутации в гене katG, 315 кодоне и области fabG-inhA, обуславливающие устойчивость к изоназиду и отражающие формирование хронически устойчивого туберкулеза.
  2. В результате апробации генов embB, rpsL, rrs и pncA, gyrA, tlyA, t500UmycbR, детерминирующих устойчивость к препаратам второго ряда, были подобраны праймеры и отработаны оптимальные условия ПЦР. Определено 24 различных генотипа, из которых 19 (32,6%) были уникальными, оставшийся 21 (67,4%) изолят M. tuberculosis входил в 5 кластеров.
  3. В результате MIRU-VNTR генотипирования установлено преобладание генотипа W-Beijing, преобладающго среди молодых индивидуумов и являющимся показателем роста передачи туберкулеза.
  4. Генотип W-Beijing преобладает как среди впервые выявленных больных, так и среди больных с повторными случаями туберкулеза и составляет 70,0% и 85,0% соответственно.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Информационный бюллетень, ВОЗ, Копенгаген, 19 марта 2013г. www/euro .who.int|_data|.

2. Ahmad S., Mokaddas E. Contribution of AGC to ACC and other mutations at codon 315 of the katG gene in isoniazid-resistant M.tuberculosis isolates from the Middle East // Int J Antimicrob Agents 2004. - P. 1138-1152.

Год: 2014
Город: Шымкент
Категория: Медицина