Изучение химического состава и разработка параметров стандартизации сухого экстракта из листьев эвкалипта

АННОТАЦИЯ

Изучены качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ сухого экстракта из листьев эвкалипта прутовидного, полученного после производства эфирного масла. Установлено, что экстракт содержит аминокислоты, моносахариды, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды, дубильные вещества гидролизуемой группы. Определено количественное содержание основных групп БАВ. Разработаны параметры стандартизации сухого экстракта из листьев эвкалипта, полученного в результате комплексной переработки лекарственного растительного сырья.

Ключевые слова: стандартизация, химический состав, сухой экстракт, листья, эвкалипт прутовидный.

В современных условиях особое значение приобретают вопросы рационального использования лекарственных растительных ресурсов, комплексной переработки растительного сырья и создание на его основе новых лекарственных средств. Такой подход позволяет обеспечить расширение номенклатуры препаратов, рационально использовать природные ресурсы, повысить рентабельность производства и уменьшить негативное его влияние на окружающую среду.

Ранее нами на базе Национального фармацевтического университета (Украина, Харьков) была разработана комплексная технология получения нового лекарственного средства из шрота листьев эвкалипта прутовидного после производства густого экстракта хлорофиллипта [1, 5].

Продолжая исследования в этом направлении, целесообразно было разработать способ получения сухого экстракта листьев эвкалипта после производства эфирного масла. Поскольку ежегодно в Украине отходами производства эфирного масла эвкалипта становятся около 100 тонн шрота листьев эвкалипта и 3 млн. литров водной вытяжки, которые содержит значительное количество БАВ.

В результате наших исследований была разработана технология комплексной переработки листья эвкалипта, которая позволяет последовательно получить эфирное масло и сухой экстракт, состоящий из суммы водного и 50% спиртового извлечений из указанного сырья. На разработанный способ получения сухого экстракта поданы документы на получение патента Украины на изобретение, поскольку предварительные фармакологические исследования показали, что экстракт проявляет антимикробную, выраженную противовоспалительную и анаболизирующую активность.

Поэтому целью наших дальнейших исследований было изучить химический состав полученного сухого экстракта из листьев эвкалипта и разработать параметры его стандартизации.

Материалы и методы. Объектом нашего исследования был сухой экстракт из листьев эвкалипта (Folia E. viminalis Labill.), полученный путем комплексной переработки листьев после получения эфирного масла.

Для установления качественного состава экстракта использовали общепринятые методы исследований - качественные реакции, бумажную (ПХ) и тонкослойную хроматографии (ТСХ) [1,2,4].

Качественный и количественный анализ свободных и связанных аминокислот в экстракте из листьев эвкалипта проводили с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа фирмы Agilent Technologies (модель 1100) при стандартных условиях. Для хроматографирования использовали колонку АА 200х2,1 мм и защитную передколонку; как подвижную фазу - раствор A (20 мМ натрия ацетата и 0,018 % триэтиламин, доведенный до pH 7,2 1-2% уксусной кислотой, с добавлением 0,3 % тетрагидрофурана, и раствор B (40% CH3CN , 40 % MeOH и 20 % 100 мМ натрия ацетата, доведенный до pH 7,2 1-2% уксусной кислотой); объемная скорость потока - 0,45 мл/мин, температура колонки - 40°C; детектирование проводили с помощью УФ-детектора после передколонковой дереватизации сначала о-фталевым альдегидом (OPA-реактив), а затем 9-флуоренилхлорформатом (FMOC-реактив) для проявления пролина [2]. Идентификацию аминокислот проводили по времени удержания стандартов соответствующих аминокислот (ТУ 6-09-3147-83).

Анализ моносахаридного состава экстракта проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы Agilent Technologies (модель 1100) при стандартных условиях. Для проведения анализа была использована карбогидратная хроматографическая колонка размером 7,8/300 мм «Supelcogel-C610H» и был установлен такой режим хроматографирования: скорость подачи подвижной фазы 0,5 мл/мин, элюент 0,1% водный раствор H3PO4, рабочее давление элюента - 33-36 кПа, температура термостата колонки - 30°С, объем пробы - 5 мкл. Параметры рефрактометричес-кого детектирования были такие: масштаб измерения 1,0; время сканирования 0,5 с. Идентификацию моносахаридов проводили по времени удержания стандартов.

Определение качественного состава и количественного содержания фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ с помощью хроматографа Agilent Technologies (модель 1100) при стандартных условиях. Для проведения анализа была использована хроматографическая колонка размером 2,1/150 мм, которая была заполнена октадецилсилильним сорбентом зернистостью 3,5 мкм « ZORBAX-SB C-18». Анализ проводили при следующих условиях: температура термостата - 35 °С, скорость потока подвижной фазы - 0,25 мл/мин; как подвижную фазу использовали раствор А (0,1 % H3PO4, 180 мкл/л триэтиламин, 3 мл/л тетрагидрофуран в воде) и раствор В (MeOH) в соотношении 90:10 (первые 8 мин), 70: 30 (с 8 по 24 мин), а с 24 мин использовали только раствор В; рабочее давление элюента - 240-300 кПа. При анализе были настроены параметры детектирования: масштаб измерения - 1,0; время сканирования - 0,5 с;

параметры снятия спектра - каждый пик 190-600 нм. Идентификацию фенольных соединений проводили по времени удержания стандартов гидроксикоричных кислот и флавоноидов и их спектральными характеристиками.

С целью стандартизации сухого гидрофильного экстракта листьев эвкалипта определяли ряд числовых показателей для четырех серий экстракта, полученных комплексной переработкой. Анализы проводили в соответствии с требованиями и методиками Государственной Фармакопеи Украины [3].

Результаты и обсуждение. В результате предварительного химического и хроматографического исследования полученных экстрактов установлено наличие таких групп БАВ, как производные гидроксикоричные кислоты, флавоноиды и полифенольные соединения, аминокислоты и сахара.

В результате исследования аминокислотного состава сухого экстракта из листьев эвкалипта установлено 15 свободных и 14 связанных аминокислот, девять из которых являются незаменимыми: треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, лизин и аргинин. В экстракте преобладают тирозин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты и фенилаланин. Содержание свободных аминокислот в экстракте составляет 0,24 ± 0,02%, а содержание связанных - 0,32 ± 0,02%.

В результате исследования моносахаридного состава экстракта из листьев эвкалипта установлено 4 моносахарида. В экстракте были идентифицированы глюкоза, галактоза и рамноза, а после гидролиза - арабиноза.

В экстракте из листьев эвкалипта было обнаружено 12 веществ, 8 из которых идентифици-ровали как галловую, протокатехиновую, эллаговую кислоты, кемпферол, кверцетин, кверцетин-3-О-арабинозид, мирицетин-3-О-арабинозид и кверцетин-3-О- галактозид. В экстракте отмечается высокое содержание галловой и эллаговой кислот, их производных и производных кверцетина. Вещества, которые не удалось идентифицировать: глюкозиды, арабинозиды, галактозиды кемпферола и кверцетина, а также производные галловой, катехиновой и кофейной кислот.

В результате исследований предложены такие параметры стандартизации сухого экстракта из листьев эвкалипта.

Описание. Экстракт - аморфный гигроскопический порошок от светло-коричневого до коричневого цвета, со специфическим запахом.

Идентификация. 1 г экстракта вносят в мерную колбу емкостью 100,0 мл, растворяют в воде очищенной и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (раствор А).

К 5 мл раствора А добавляют 1 мл раствора железа (III) хлорида, появляется темносинее окрашивание (фенольные соединения).

К 5 мл раствора А в пробирке добавляют 3 мл 3% раствора алюминия хлорида спиртового и смотрят в УФ-свете при длине волны 366 нм, наблюдается зеленоватожелтая флюоресценция (флавоноиды). Остаточные количества органических растворителей (спирт этиловый) [3]. Около 1 г (точная навеска) экстракта вносят в мерную колбу емкостью 10 мл, растворяют в 7 мл воды, добавляют 1 мл ацетона и 1,2- дихлорэтана (внутренние стандарты), доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

По 1 мкл полученного раствора и раствора стандартного образца (СО) спирта этилового хроматографируют на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором, получая не менее 5 хроматограмм в следующих условиях: колонка кварцевая капиллярная НР- FFAP фирмы Hewlett Packard (США), в размере 30 м х 0,53 мм, неподвижная фаза - полиэтиленгликоль, модифицированный терефталевой кислотой, с толщиной слоя 1 мкм. Допускается использование аналогичных колонок, отвечающих требованиям теста «Проверка пригодности хроматографической системы»; температуру колонки программируют: 70 °С в течение 4 мин, повышение температуры со скоростью 20 °С / мин до 140 °С, выдерживают в течение 5 мин, температура испарителя - 130 ° С, температура детектора - 220 °С; объемная скорость газа-носителя (гелий) - 5 мл/мин, распределение потока - 1:5.

Содержание спирта этилового в составе экстракта не должно превышать 1,0 %.

Потеря в массе при высушивании. Не более 5,0 %. Определение проводят согласно ДФУ 2001, с. 492 [3].

Тяжелые металлы. Не более 0,01 %. Определение проводят согласно ДГФУ 2001, с. 493; 2.4.8, А [3].

Микробиологическая чистота. Опыт проводят в соответствии с требованиями ДФУ 2001, 2.

Препарат в условиях опыта обладает антимикробным действием.

Посевы на плотные питательные среды № 1 и № 2 проводят прямым посевом, используя двухслойный агарный метод в разведении 1:10. Посев в жидкие питательные среды № 3 и № 8 проводят прямым посевом в разведении 1:10.

В 1г препарата допускается не более 100 микроорганизмов, в том числе и грибов. Не допускается наличие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

Количественное определение. Количественное определение БАВ проводили спектрофотомет-рическим методом. Флавоноиды в пересчете на рутин после образования комплекса с алюминия хлоридом определяли при 417 нм; полифенольные соединения в пересчете на галловую кислоту - при длине волны 270 нм. Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте должно быть не менее 3%. Содержание полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в экстракте - не менее 20%.

Все четыре серии полученных экстрактов отвечали требованиям разработанного проекта методик контроля качества.

Выводы. Изучен качественный состав и количественное содержание аминокислот, моносаха-ридов, гидроксикоричных кислот, флавоноидов и гидролизуемых дубильных веществ. Разработаны параметры стандартизации сухого экстракта из листьев эвкалипта, полученного в результате комплексной переработки лекарственного растительного сырья.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. A new herbal remedy with anabolic activity on the basis of hydrophilic compounds of Eucalyptus leaves / Oleg M. Koshoviy, Victoria S. Kyslichenko, Victoria V. Velma, Andrej M. Komisarenko // Herba Polonica. - 2008. - Vol. 55. - № 1. - P. 72 - 77.
  2. Амінокислотний та цукровий склад спиртового екстракту з листя шавліі лікарськоі / О. М. Кошовий, Г. П. Зайцев, А. М. Ковальова, А. М. Комісаренко // Вісник фармаціі. - 2011. - № 1. - С. 49-52.
  3. Державна Фармакопея Украіни/ Державне підприемство “Науково-експертний фарма- копейний центр”. - 1-е вид. - Х.: РІРЕГ, 2001. - 556 с.
  4. Дослідження фенольних сполук листя евкаліпта / О.М. Кошовий, А.М. Комісаренко, А.М. Ковальова, Л.М. Малоштан, І.М. Мудрик // Фармаком. - 2005. - № 2/3. - С. 151 - 161.
  5. Пат. на винахід № 79383 Украіна, МПК А61К 36/61, А61Р 29/00. Спосіб одержання засобу з протизапальною та анаболічною активністю / О.М. Кошовий, О.М. Гомон, І.М. Мудрик, Л.М. Малоштан, Л.І. Білостоцька, А.М. Комісаренко, Л.О. Чайка, А.М. Ковальова, С.М. Комісаренко, Н.І. Ковальчук (Украіна). - № а 2005 11279; Заявл. 28.11.2005; Опубл. 11.06.2007, Бюл. № 8. - 5 с.
Год: 2014
Город: Шымкент
Категория: Медицина