На протяжении многих лет осуществляется оценка эпидемической значимости холерных вибрионов различными способами [1,2, 4]. Особое значение, придается тесту определения гемолитической активности по пробе Грейга и определению вирулентности на кроликах сосунках. Дополнительно, токсигенность штаммов определяется по лизису, «ctx +» и «ctx -». Наиболее перспективным, но не всем доступным считался метод определения генов вирулентности ctx А и tcpA. В настоящее время в связи с развитием генной диагностики появилась возможность определять токсигенность холерного вибриона методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)[6,7]. Территория ЮКО относится к I типу по эпидемической опасности. C 80-х годов 20-го столетия холерная лаборатория Шымкентской противочумной станции проводит работу по эпид. надзору за холерой. Согласно приказа Минздрава № 112 от 29 февраля 2008 года «О профилактических и противоэпидемических мероприятиях по холере на 2008-2012 годы» лабораторией проводится исследование анализов всех больных
ОКИ поступающих в стационары города, вода открытых водоемов г. Шымкента и канализационных коллекторов до и после очистки.
За 11 месяцев текущего года холерной лабораторией ШПЧС обследовано на холеру 3762 человека больных ОКИ, (от которых проведено 4303 исследования), 342 пробы воды, из них 290 - из открытых водоёмов, 62 - из городского канализационного коллектора. Из открытых водоёмов города Шымкента выделено 206 холерных вибриона non Ol серогруппы (121 - I группы Хейберга, 85 - II группы Хейберга ) и 3 штамма холерных вибрионов O1 из каналов Сарыагашского района. В текущем году исследовалась вода Большого магистрального канала, рек Бадам, Карасу, Качкар-Ата, озер Тулпар и Туркестанское. 14 вибрионов выделенных из Большого магистрального канала были исследованы классическим методом с определением рода, биовара, серовара, биохимических свойств, чувствительности к антибиотикам отношением к фагам.
Выделенные вибрионы холеры non OI обладали следующими свойствами: 1) микроскопия - частичная агглютинация О - холерной сывороткой 1/100 (склеивание единичных клеток вибрионов); 2) биохимические свойства - I группа Хейберга (сахароза +, манноза +, арабиноза -); 3) чувствительность к антибиотикам - высокочувствительны к цефалоспоринам (офлоксацин, ципролет, ципрокса, сифлокс: МЗД- 0,195ед/мл), чувствительны к левомицетину ( МЗД - 0,39), малочувствительны к тетрациклинам (МЗД - 1,56); 4) фаготипирование - «ctx +» - отрицательно, «ctx -» - отрицательно, что характерно для авирулентных штаммов. 5) гемолиз эритроцитов барана через 2 и через 12 часов отсутствовал (реакция Грейга) как у вирулентных штаммов содержащих холероген. Штаммы с неустойчивой гемолитической активностью встречались и ранее как среди О1 так и среди non OI вибрионов [3,5].
В связи с несоответствием в 4 и 5 пунктах было проведено дополнительное исследование холерогенности на кроликах сосунках. Десятидневных кроликов - сосунков заражали двумя испытуемыми штаммами в разведениях 1/100, 1/1000, 1/10000. Все кролики после заражения через 2-е суток остались живы, что свидетельствует об отсутствии холерогена. Для окончательного определения вирулентности провели ПЦР исследование с использованием набора реагентов «АмплиСенс Vibrio cholerae - FL », позволяющего идентифицировать ДНК холерных вибрионов всех серогрупп по наличию последовательности Hly, идентифицировать патогенные штаммы по наличию основных факторов вирулентности - GxA, tcpA, определять принадлежность к серогруппе OI по наличию амплификации в мишени wbeT и принадлежность к серогруппе О - 139 по наличию амплификации мишени wbfR. Всего взято 14 гемолиз негативных штаммов вибрионов холеры non ОТ. Исследование проводилось последовательно с 4 и 10 штаммами. Постановка реакций осуществлялась в формате «мультиплекс» в пробирках содержащих ПЦР-смесь-1-FRT Vibrio cholerae скрин и ПЦР-смесь-1-FRT Vibrio cholerae тип с использованием «горячего старта» смотрите в Таблицу 1.
102
103
104
На канале детекции JOE/Yellow определено, что все образцы относятся к роду Vibrio cholerae. На графиках выше пороговой линии отображены данные для внутренних контрольных образцов и кривые отображающие амплификацию образцов штаммов выделенных из воды (рис3).
105
Итак, все 14 исследуемых проб относятся к роду Vibrio cholerae, серогруппе non OI , не содержат генов CtxA и tcpA и следовательно являются неэпидемичными и нетоксигенными.
В связи с неблагополучной обстановкой по ОКИ в Узбекистане сотрудниками холерной лаборатории ШПЧС произведен забор воды каналов Сарыагашского района берущих начало в Узбекистане. Из реки Келес, Восточно-Ташкентского и Северо-Ташкентского каналов выделено 3 холерных вибриона 01 серогруппы, Эльтор, Огава, которые были исследованы как классическим методом , так и методом ПЦР. В тот же день был получен ответ: все 3 исследованные культуры относятся к роду Vibrio cholerae, серогруппе OI , содержат гены сіхА и tcpA и следовательно являются эпидемичными и токсигенными (рис 4).
Выводы:. 1. Холерные вибрионы выделенные из водоемов города не представляют эпидемической опасности. 2. Напротив, культуры, полученные из проб воды Сарыагашского района, граничащего с Узбекистаном, содержат токсин холероген и являются эпидемически опасными для населения. В связи с этим необходимо усилить эпид контроль за водоемами Сарыагашского района.
Заключение. Сочетание традиционных и современных методов исследования позволило однозначно определить эпидемическую значимость холерных вибрионов, выделенных из открытых водоемов города и области.
ЛИТЕРАТУРА
- Кожухов И.Г., Рахимов К.Р., Исаева Г.П.,и др. Характеристика вирулентных свойств вибрионов холеры Эльтор, циркулирующих в Южно-Казахстанской области // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы.-2006.- Вып. 1-2. - С.11-15.
- Кожухов И.Г., Исаева Г.П., Атовуллаева Л.М.Особенности динамики выделения вибрионов холеры Эльтор разных сероваров из открытых водоемов на юге Казахстана // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы.-2005.- Вып. 1-2. - С.65-68.
- Михайлюк Н.И., Гражданов А.К., Филимонова Л.В. и др. Гемолитическая активность и чувствительность к фагам холерных вибрионов не О1 серогруппы, выделенных из воды открытых водоемов Западно- Казахстанской области // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы.-2006.- Вып. 1-2. - С.15- 18
- Семиотрочев В. Л. Группы видов Vibrio сһоіегае,имеющие различную эпидемическую значимость // Журн. микробиол. -1990г.
- Утепова И.Б., Сагимбек У.А., Атшабар Б.Б. Популяционная изменчивость холерных вибрионов О1 серогруппы, выделенных на территории Республики Казахстан в 1998-2003гг. // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы.-2005.- Вып. 1-2. - С.55-60.
- Утепова И.Б., Куница Т.Н., Темиралиева Г.А. и др. Значение молекулярно-генетических исследованийв лабораторно-генетической диагностике холеры // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы.-2006.- Вып. 1-2. - С.42-45.
- Утепова И.Б., Атшабар Б.Б., Сагимбек У.А. и др. Лабораторная диагностика холеры в Республике Казахстан и пути её совершенствования (обзор проблемы) // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы.-2006.- Вып. 1-2. - С.31-41.