Выделение, культивирование и определение дифференцировочного потенциала мезенхимальных стоволовых клеток синовиальной оболочки человека

В последнее время активно разрабатываются методы клеточной терапии, в особенности трансплантации стволовых клеток (СК) [1, 2], в том числе мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из синовиальной оболочки человека, с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканей, а также восстановления функций различных органов, в частности, дефектов коленных суставов и хрящей.

Мезенхимальные стволовые клетки, или МСК являются мультипотентными, т. е. обладают способностью дифференцироваться в различные типы клеток соответствующей ткани, именно: остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки), адипоциты (жировые клетки), фибробласты (клетки соединительной ткани), миобласты (мышечные клетки), кардиомиоциты и нейроциты. Кроме того, МСК имеют большой потенциал к самообновлению и сохранению свойства мультипотентности.

Мезенхимальные стволовые клетки синовиальной оболочки также характеризуются рядом свойств, такие как высокая способность к пролиферации и адгезии к пластику, фибробластоподобная морфология, образование колоний в культуре и легко индуцируемая дифференцировка. Эти клетки могут быть у пациента, страдающего тем или иным заболеванием и использованы для аутологичной трансплантации и заместительной терапии, позволяя тем самым избежать проблем с реакцией отторжения трансплантата [3].

Более того, было показано, что мезенхимальные стволовые клетки обладают низкой иммуносупрессивную активность как в условиях in vitro и in vivo, что дает возможность использовать их не только для аутогенной, но и для аллогенной трансплантации [4].

Синовиальная оболочка – внутренний слой суставной сумки или костно-фиброзного канала, который выстилает всю поверхность суставной полости и связки, расположенные в суставе, за исключением хрящевых участков. Синовиальная оболочка и синовиальная жидкость являются хорошим источником МСК. Она является единственным источником ткани, которая продуцирует гиалиновый хрящ в такие заболевания, как синовиальный хондроматоз и костно-хрящевые шпоры при остеоартрите, которая предполагает, что синовиальная оболочка служит источником клеток для восстановления суставного хряща.

В синовиальной оболочке описаны такие маркерные молекулы как, CD9+, CD44+, Cd54+, CD90+ и CD166+, которые проявляют мультипотентность в хондрогенную, остеогенную и адипогенную линии [5]. Маркеры CD44+, Cd54+ и CD90+, в частности, участвуют в образовании межклеточных контактов, вовлечены в процессы адгезии к внеклеточному матриксу, экспрессируются эндотелиоцитами, макрофагами, лейкоцитами и нейронами.

Другими преимуществами использования МСК синовиальной оболочки в терапии хрящевых дефектов являются:

  1. возможность быстро и безболезненно получить биоматериал с помощью артроскопических процедур;
  2. способность восстановиться после биопсии;
  3. возможность выделить достаточно большое количество МСК, до 20000/мг;
  4. они обладают высоким пролиферативным и хондрогенным потенциалом вне зависимости от возраста пациента.

Забор синовиальной оболочки человека производится асептическим путем из коленного сустава с помощью артроскопических процедур при наличии информированного согласия больного.

Для выделения клеток, синовиальная оболочка была обработана смесью антибиотиков-антимикотиков (100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В). Далее материал измельчали на мелкие кусочки, размером 1-2 мм, и обрабатывали раствором коллагеназы II типа в течение 12-16 часов при 37°С и 5% СО2.

Коллагеназа способна расщеплять пептидные связи в коллагеновых волокнах, высвобождая, таким образом, клетки, находящиеся в глубоких слоях синовиальной оболочки. По истечению 12-16 часов, полученную суспензию синовиальных клеток профильтровали через нейлоновый фильтр, с размером пор 70 мкм, для удаления оставшихся фрагментов ткани. После двукратной отмывки фосфатно-солевым буфером, клетки ресуспендировали в питательной среде DMEM и определяли их количество и жизнеспособность после окрашивания трипановым синим. Количество определяли с помощью камеры Горяева.

Для получения первичной культуры МСК, клетки культивировали в полной питательной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, высеивали в 25 см2 флаконы и оставляли в СО2-инкубатор.

Через каждые три дня неприкрепленные к пластику, а также мертвые клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до образования 80% конфлюэнтного монослоя. При достижении 80% конфлюэнтного монослоя удаляли питательную среду, 2 раза промывали фосфатно-солевым буфером и производили пассаж с интервалом 5-7 дней. Смена среды осуществлялась каждые 2-3 дня.

Дифференцировочный потенциал МСК определяли после 4 пассажа, рассеивая в шестилуночные планшеты, и культивировали в полной питательной среде.
Для направленной дифференциации МСК в остеобласты на четвертом пассаже после культивировании, клетки сняли с пластикового флакона с помощью 0,25% трипсина для удаления внеклеточного матрикса. После подсчета клеток произвели посев DMEM с 10% ЭТС, 10-7 М-дексаметазона, 10 мМ β глицерол-фосфата и 50 мкМ аскробат-2-фосфат доводя до 500 мкл. Смену среду проводили 2 раза в неделю и поддерживали культуру 2-4 недели.

Для направленной дифференциации мезенхимальынх стволовых клеток в хондроциты, монослой клеток также на четвертом пассаже культивирования сняли с пластикового флакона с помощью 0,25% трипсином.

После подсчета клеток произвели посев с добавлением среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10-7 дексаметазона, 1% ITS, 50 мкМ аскорбиновой кислоты, 2 мМ пирувата натрия, 50 мкг/мл L-пролина и 20 нг/мл TGF-β1. Смену среды производили 2 раза в неделю и культивировали в течение 21 дня.

Год: 2014
Город: Астана
Категория: Биология