Одной из причин высокой устойчивости нефти в окружающей среде является их ограниченная растворимость в водных средах, поэтому такие соединения малодоступны для микроорганизмов и с трудом подвергаются биодеградации.
При изучение оптимальной параметры культивирования активных углеводоро- докисляющих микроорганизмов. Выявлено, что нефтеокисляющие микроорганизмы показали хороший рост при диапазоне рН среды 7.0–9.0, так же определяли оптимальный рост углеводородокисляющих микроорганизмов, установленно оптимальной темпера- туре +30ºС. Все исследуемые активные углеводородокисляющие микроорганизмы обладают высокой эмульгирующей активностью и устойчивы высоким концентрациям поваренной соли.
Введения
В Казахстане продолжается интенсивное освоение ресурсов углеводородного сырья. Наряду с добычей и транспортировкой нефти и газа отмечается тенденция усовершенствования и дальнейшего развития нефтехимической промышленности. Центром развития нефтяной и нефтехимической отрасли стал Западный Казахстан. Масштабные разработки и добыча углеводородного сырья ведутся в Актюбинской, Атырауской, Западно-Казахстанской, Мангыстауской и Кзылординской [1].
На современном уровне развития нефтегазового комплекса не представляется возможным полностью исключить его негативное воздействие на окружающую среду. Проблема очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей, а иногда и экологического вреда применения для этих целей механических и физико-химических способов очистки. Наиболее перспективными в настоящее время являются методы биологической очистки экосистем при помощи микроорганизмов, использующих органические загрязнители в качестве источника углерода, при этом токсичные нефтепродукты трансформируются до углекислого газа и воды [2, 3, 4].
Для предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности вопросы охраны окружающей среды становятся все более актуальными. Возросшая экологическая опасность данных предприятий связана с выбросами в окружающую среду вредных веществ, появлением новых, зачастую трудноразлагаемых отходов и несовершенными природоохранными мероприятиями [5].
В связи с разнообразием почвенно-климатических условий, физико-химических свойств нефти и нефтепродуктов, уровня и срока действия загрязнения и стоимости мероприятий по рекультивации проблема поиска оптимальных и адаптированных к конкретным условиям методов остаётся весьма актуальной. Так, на территории Западного-Казахстана и других стран существует немало почв, в том числе и нефтезагрязнённых, с повышенной кислотностью и высокой засоленностью почва которая обусловлена естественными или антропогенными факторами. Климат Западного - Казахстана относится к резко континентальным, с жарким сухим летом и холодной малоснежной зимой, со значительными амплитудами сезонных и суточных температур. Для него характерна большая сухость воздуха. Осадков выпадает менее 200 мм в год. Примитивные приморские почвы не имеют развитого гумусового горизонта. Эти почвы не пригодны для сельскохозяйственного освоения, могут быть лишь использованы для выпаса сельскохозяйственных животных. Почвенный покров представлен в основном бурыми, солонцеватыми и песчаными типами почв, для которых даже слабое загрязнение углеводородами приводит к нарушению равновесия в почвенной экосистеме [6].
В этой связи особую актуальность приобретают исследования направленные на выделение и отбор наиболее активных углеводородокисляющих микроорганизмов, способных трансформировать и утилизировать нефтяные углеводороды. Имеется ряд российских и зарубежных препаратов, разработанных на основе микроорганизмов, предназначенных для ремедиации нефтезагрязненных территорий. Несмотря на это поиск местных аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов на территории Казахстана, где происходит основная добыча нефти актуален, это связано, в первую очередь, с высокой степенью аридности климата и особенностями пустынных почв.
Целью исследование – изучить оптимальные параметры культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов.
Материалы и методы
С целью проведения научно-исследовательских работ использовали следующие материалы:
Микроорганизмы: Выделенные углеводородокисляющие микроорганизмы из нефте- загрязненных почв Западного Казахстана.
Питательные среды: сухой питательный бульон и агар (СПБ, СПА) ).
Определение оптимального диапазона кислотности и солености среды для исследуемых культур микроорганизмов проводили на среде СПБ (рН от 3 до 9, NaCl от 3% до 10%). Уровень рН среды устанавливали путем добавлением HCl или 3 % KOH.
Для определения оптимальной температуры культивирования, микроорганизмы выращивали при температурах от 20 до 40 0С. Наличие роста отмечали визуально по 4- бальной шкале.
Определение эмульгирующей активности. Эмульгирующую активность определяли визуально согласно методике [7] по четырёхбалльной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта, полученного после центрифугирования культуры, выращенной на среде с вазелиновым маслом, согласно методике в нашей модификации. Пробу культуры объёмом 1 мл, выращенной на среде В-Д с вазелиновым маслом в течение 48 ч., центрифугировали в течение 3 мин при 10000 g на микроцентрифуге «Eppendorf 5415» (Германия, 2005). Супернатант (1 мл) переносили в пробирки, добавляли 1 мл среды В-Д и 0,5 мл вазелинового масла. Содержимое пробирки перемешивали на миксере в течение 2 мин. В качестве контроля использовали 0,5 мл вазелинового масла в 2 мл среды В-Д. Оценка поверхностной активности проводилась по оптической плотности исследуемых образцов на КФК-2 при длине волны 540 нм [8].
Результаты и обсуждение
Одним из основных факторов влияющих на скорость биодеградации нефти, является температура и рН среды. Температура влияет на нарушение нефти, воздействуя на физическую природу и химический состав нефти, на скорость метаболизма углеводородов микроорганизмами и состав микробного сообщества [9]. При низких температурах возрастает вязкость нефти, снижается испарение токсичных соединений, уменьшаются темпы биодеградации. Считается, что для развития нефтеокисляющих бактерий и интенсификации процесса очистки воды и почвы от нефти оптимальными являются мезофильные условия +20-30ºC. При температуре +6-15ºC интенсивность трансформации нефти снижается в 2,5-4 раза, при +40ºC рост бактерий ограничивается и процесс замедляется [10].
У отобранных культур микроорганизмов изучали способность их роста в присутствии различных концентраций хлорида натрия, кислотности среды и температуры, в качестве единственного источника углерода и энергии использовали нафталин.
Результаты по визуальной рост культур микроорганизмов при разных значениях pH приведены в таблице 1.
Для оценки роста нефтеокисляющих микроорганизмов в зависимости от различных диапазонов рН среды, использовали питательную среду СПБ с добавлением дизельного топлива.
Таблица №1. Визуальная роста культуры микроорганизмов при разных значениях.
Из табличных данных видно, что культуры микроорганизмов при разных значениях pH показало, что наиболее благоприятной средой для репродукции микроорганизмов является диапазон значении pH среды от 5 до 9,0, кроме культур Т2, U2.4 U2.6 при значение pH показал отсутствия роста.
Сильнокислая среда (pH 3) не благоприятна для роста углеводородокисляющих микроорганизмов. Одной из причин высокой устойчивости нефти в окружающей среде является их ограниченная растворимость в водных средах, поэтому такие соединения малодоступны для микроорганизмов и с трудом подвергаются биодеградации.
Для определения оптимального роста микроорганизмов необходима соответс- твующая его видовым потребностям температура. С этой целью нами изучен рост отобранных микроорганизмов при разных температурных режимах. Результаты опыта представлены в таблице 2.
Таблица 2.Визуальная роста микроорганизмов при разном температурном режиме
Изучение влияния температуры на накопление культур микроорганизмов показало, что, при температурах от 20 до 35°С все изоляты дали интенсивный рост микро- организмов. Тогда как, при 40°С только у изолятов Т2 и ЖН2 наблюдали отсутствие роста. Следовательно, можно отнести всех выделенных культур мезофильным видам бактрий.
На эффективность биоочистки нефтезагрязненной почвы в значительной степени влияет уровень содержания в почве минеральных солей и степень загрязнения нефтью. По данным литературы [11], почва Западной – Казахстанской области сильнозасоленная – более 4%. Высокое содержание солей подавляет жизнедеятельность многих микро- организмов.
В следующей серии опытов была проведена визуальная оценка роста выделенных культур при различных концентрациях поваренной соли от 3% до 9%. Все исследо- ванные культуры микроорганизмов хорошо росли на среде СПА, содержащей 3% и 5% поваренной соли. На среде с содержанием высокой концентрации поваренной соли (7 %, 9 %) все изоляты, кроме 14/2 культуры показали плохой рост (таблица 2). Результаты проведенных исследований представлено в таблице 3.
Таблица 3. Визуальное рост нефтеокисляющих микроорганизмов на среде с различным концентрациям поваренной соли
Помимо высокого засоления почвы на эффективность биоутилизации нефти УОМ оказывает влияние и способность УОМ продуцировать биоПАВ (биосурфактанты, биоэмульсины). Известно, что многие виды микроорганизмов способны продуцировать поверхностно-активные вещества, которые превращают углеводороды нефти в эмуль- сию, что способствуют лучщему усвоению их микроорганизмами [12]. Микроорга- низмы, продуцирующие биосурфактанты, проявляют высокую поверхностную активность при росте на гидрофобных субстратах, таких как гексадекан, вазелиновое масло и т.д., поэтому для изучения эмульгирующей активности нами использовано вазелиновое масло.
Эмульгирующую активность выделенных изолятов определяли визуально по четырёхбалльной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта при длине волны 540 нм, полученного после центрифугирования культуры микроорганизмов, выращенной на среде с вазелиновым маслом. Результаты эмульгирующей активности углеводородокисляющих микроорганизмов представлены в таблице 4.
Таблица 4. Эмульгирующая активность микроорганизмов-деструкторов нефти
Изучение способности бактерий к синтезу естественных поверхностно-активных веществ (ПАВ, биосурфактантов, биоэмульгаторов), которые снижают поверхностное натяжение и способствуют повышению степени биодеградации, показало, что индекс эмульгирования с использованием вазелинового масло у всех используемых штаммов различен. При визуальной оценке обладали хорошей поверхностной активностью, по оптической плотности показало высокую оптическую плотность супернатанта – больше 0,1 ед., идекс эмульгирование, использованнных культур варировало в пределах 6,6%- 60%. На основании полученных результатов изучаемые микроорганизмы продуци- ровали в определенной степени биоПАВ относящиеся к экзо-типу (биосурфактанты экскретируются в культуральную жидкость).
Вывод
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что углеводородокислющие микроорганизмы показали хороший рост при: диапазоне рН среды 7,0-9,0, оптимальной температуре +30ºС и устойчивы при концентрации поваренной соли от 5 до 9%. Все исследуемые изоляты эмульгировали вазелиновое масло, т.е продуцировали биоПАВ.
Литература
- Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. - М.: Недра, 1997. - 470 с.
- Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - № 5. - С. 534-539.
- Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997. - № 2. - С. 198-201.
- Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - № 3. - С. 312-316.
- Кобзев Е.Н., Петрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов - нефтедеструкторов в открытой системе // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т. 37. - № 4. - С. 413-417.
- Надиров Н.К. Нефть и газ Казахстана. - Алматы: Ғалым, – Ч. 2 - С. 5-26.
- Диаров М.Д. Экология и нефтегазовый комплекс. - Алматы: Галым, 2003. –Т. 2. - 832 с.
- Лурье Ю.Ю., Рыбникова А.И. Химический анализ производственных сточных вод. – М.: Химия, 1974. - 290 с.
- Francy D.S., Thomas J.M., Raymond R.L., Ward H. Emulsification of hydrocarbons by subsurface bacteria // J. of Industrial microbiology. – 1991. – Vol. 8. – P. 237-246.
- Cirigliano M.C., Carman G.M. Isolation of bioemulsifier from Candida lipolitica // Appl. And Environ. Microbiol. – 1984. – P. 747-750.
- Desai D., Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potencial // Microbiol. Molecular Biol. Rev. - 1997. - Vol. 61. - P. 47-64.
- Burd , Ward O.P. Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates: the role of biocurfactants // Biotechnol. Tech. – 1996. - Vol. 10, № 5. - P. 371-374.