Иммунофенотипирование основных популяций лимфоцитов и определение содержания Т регуляторных лимфоцитов и лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis у людей, иммунизированных живой чумной вакциной.
Обследовали 13 здоровых взрослых людей, иммунизированных живой чумной вакциной EV. 6 человек были вакцинированы первично, 7 человек - повторно (не ранее чем через 1 год после предыдущей вакцинации). Вакцинацию проводили методом скарификации, одна доза вакцины содержала 3 х109 живых микробных клеток. Кровь для исследования брали из локтевой вены до вакцинации и на 2, 4-6, 7-9, 13-14, 20-21, 27, 34, 48 и 62 дни после вакцинации.
Основные популяции лимфоцитов (CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, HLA-DR) и Т- регуляторные лимфоциты CD4/CD25/FoxP3) определяли при помощи лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител , используя “двойную метку, на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickenson, USA) в программе CellQuest. Полученные результаты сравнивали с данными, полученными в контрольной группе (50 условно здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет) и референтными границами нормы от производителя моноклональных антител. Содержание лимфоцитов с рецепторами (ЛфР) к капсульному антигену (F1) и ЛПС Y. pestis определяли в реакции адгезии к лимфоцитам иммунореагентов и, полученных нами конъюгацией F1 и ЛПС c эритроцитами быка, фиксированными ацетальдегидом. Параллельно выполняли такие анализы с контрольным реагентом - эритроцитами, не нагруженными антигенами Y. pestis.
Показано, что содержание основных популяций лимфоцитов (CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, HLA-DR) у всех обследованных людей, вакцинированных живой чумной вакциной, не выходило за пределы определенных норм и практически не изменялось в динамике. Среднее содержание Т –регуляторных лимфоцитов в группах первично и повторно вакцинированных также достоверно не различалось
ЛфР к антигенам Y. pestis не обнаружены до вакцинации и выявлены у же на 2-ой день после вакцинации. С 20-го дня ЛфР к антигенам Y. pestis не определялись. Следует отметить, что содержание лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis на 2-ой день после вакцинации в группе первично вакцинированных было существенно меньше, чем в группе вакцинированных повторно, а на 13-14 день – наоборот достоверно больше.
Таким образом, можно отметить, что кратность иммунизации живой чумной вакциной влияла на содержание и динамику лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis: при ревакцинации ЛфР появлялись в периферической крови раньше и раньше исчезали, чем при первичной вакцинации.
ВВЕДЕНИЕ. Чума была и остается одним из самых опасных инфекционных заболеваний. Природные очаги чумы занимают уже более 40¿ территории Казахстана [1]. Для профилактики чумы в Казахстане проводят вакцинацию людей, живущих или работающих в природных очагах чумы, и специалистов, работающих в противочумных организациях. В качестве вакцины используется живая чумная вакцина на основе штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ [2]. Несмотря на то, что эта вакцина применяется уже более 50 лет, иммунный ответ на эту вакцину характеризуются преимущественно лишь по определению активности антител к различным антигенам чумного микроба [2,3].
Регуляторные Т лимфоциты контролируют воспалительные реакции и специфический иммунный ответ на внедрение инфекции [4,5] Эти клетки экспрессируют FOXP3 — транскрипционный фактор, регулирующий транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвующих в супрессии иммунного ответа. Часто эти клетки так и обозначают, как FOXP3Á регуляторные Т-клетки (FOXP3Á Treg cells). Кроме того, важным маркером Т-регуляторных клеток является экспрессия на их поверхности рецептора к цитокину IL-2 — CD25, соответственно это обозначают как CD25Á клетки. Помимо этих основных маркёров Treg клетки на своей мембране экспрессируют CD62L, различные изоформы мембрано-связанной фосфатазы CD45. Различают несколько разных типов регуляторных Т-клеток: естественные Т-регуляторные клетки (T-reg1) и индуцибельные Т-регуляторные клетки (iT-reg). Индуцибельные Т-регуляторные клетки образуются под влиянием различных факторов на периферии, например, в региональных лимфатических узлах. При прямом механизме супрессии Treg взаимодействуют с эффекторными Т-клетками и гранзим B действует через перфорины, образующие канал, вызывая апоптоз в этих клетках, тем самым элиминируя активные Т-клетки. Содержание регуляторных Т лимфоцитов при вакцинации людей живой чумной вакциной не изучалось.
Известно, что иммунный ответ на вакцинацию имеет две стадии своего развития: начальную, характеризующуюся образованием популяций лимфоцитов, имеющих рецепторы к определенным антигенам, и эффекторную, характеризующуюся образованием антител соответствующей специфичности [6]. Как уже говорилось выше, эффекторная стадия иммунного ответа на живую
Таблица 1 - Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов периферической , крови вакцинированных людей чумную вакцину изучена хорошо. Исследования же начальной стадии - практически отсутствуют.
ЦЕЛЬ. Иммунофенотипирование основных популяций лимфоцитов и определение содержания Т регуляторных лимфоцитов и лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis у людей, иммунизированных живой чумной вакциной.
МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ
Обследовали 13 здоровых взрослых людей, иммунизированных живой чумной вакциной EV. 6 человек были вакцинированы первично, 7 человек - повторно (не менее чем через 1 год после предыдущей вакцинации). Вакцинацию проводили методом скарификации, одна доза вакцины содержала 3 х109 живых микробных клеток. Кровь для исследования брали из локтевой вены до вакцинации и на 2, 4-6,7-9,13-14, 20-21, 27, 34, 48 и 62 после вакцинации. Все вакцинированные люди относились к декретируемому контингенту лиц, подлежащих вакцинации против чумы, и дали добровольное информированное согласие на использование данных их обследования в научных публикациях
Определение основных популяций лимфоцитов (CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, HLA-DR), маркеры Т- регуляторных лимфоцитов CD4/CD25/FoxP3) проводили при помощи лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител, используя “двойную метку”: два типа моноклональных антител, несущих на себе различные красители (FITC - флюорисцеин-5- изотиоцонат и PE - фикоэритрин). Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickenson, USA) в программе CellQuest. Полученные результаты сравнивали с данными, полученными в контрольной группе (50 условно здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет) и референтными границами нормы от производителя моноклональных антител.
Содержание лимфоцитов с рецепторами (ЛфР) к антигенам Y. pestis F1 и ЛПС определяли в реакции адгезии к лимфоцитам иммунореагентов и, полученных нами конъюгацией F1 при помощи риванола и ЛПС без посредников c эритроцитами быка, фиксированными ацетальдегидом, как описано ранее [7]. Параллельно выполняли такие анализы с контрольным реагентом -эритроцитами, не нагруженными антигенами Y. pestis.
В работе применяли статистические методы частных сравнений серий. Результат считали значимым при Р≤0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фенотипирование основных популяций лимфоцитов
Результаты фенотипирования основных популяций лимфоцитов приведены в таблице 1.
Выявлено достоверное увеличение содержания активированных CD19 лимфоцитов на 8-й день взятия крови по сравнению с 7-м днем (15,62Ã1,4 и 11,01Ã1,4), а также в сравнении с контрольной группой (10,2Ã3,2). Признаком активации является экспрессия молекулы HLA-DR на В- лимфоцитах. Их содержание достоверно увеличилось на 8-й день. Достоверное увеличение экспрессии CD8 лимфоцитов выявлено на 7-й день тестирования в сравнении с 4-м днем (34,54Ã1,7 и 26,79Ã2,1). Это повлияло на сдвиг в соотношении субпопуляций CD4/CD8, вследствие чего, ИРИ снизился с 1,8Ã0,3 до 1,2Ã0,1. Достоверной разницы с группой контроля по этим показателям не выявлено.
|
Сроки обследов ания (день после вакцина ции) |
Число обследованных |
Содержание лимфоцитов |
соответствующей *, % |
популяции |
Соотношение содержания, ИРИ*, CD4/CD8 |
Содержание соответствующей популяции лимфоцитов*, ¿ |
||
|
CD3+ |
CD19+ |
CD4+ |
CD8+ |
CD16+56+ |
HLA-DR |
|||
|
0 |
13 |
69,76±1,7 |
13,05±1,6 |
40,15±1,7 |
31,14±0,95 |
1,3±0,1 |
11,68±2,0 |
15,64±1,6 |
|
2 |
13 |
71,75ã1,2 |
13,43ã1,2 |
43,29±1,5 |
29,50±1,2 |
1,6±0,1 |
9,35±1,3 |
15,94±1,2 |
|
4-6 |
13 |
70,94ã1,2 |
13,65ã1,2 |
42,18±1,6 |
28,66±1,4 |
1,5±0,1 |
10,59±1,5 |
15,52±1,3 |
|
7-9 |
13 |
71,17ã1,1 |
13,25ã1,6 |
42,96±2,4 |
26,79±2,1 |
1,8±0,3 |
10,93±2,4 |
14,87±1,2 |
|
13-14 |
13 |
72,68ã1,4 |
13,18ã0,9 |
45,05±3,2 |
27,50±2,1 |
1,7±1,2 |
8,27±1,5 |
13,04±0,6 |
|
20-21 |
13 |
70,01ã1,5 |
12,75ã1,2 |
40,88±2,2 |
33,87±2,0 |
1,3±0,1 |
9,56±1,2 |
14,55±1,4 |
|
28 |
13 |
69,25ã1,8 |
11,01ã1,4 |
39,59±2,2 |
34,54±1,7 |
1,2±0,1 |
13,93±1,8 |
14,22±1,8 |
|
35 |
13 |
67,00ã2,2 |
15,62ã1,4 |
39,23±2,7 |
31,58±1,6 |
1,3±0,2 |
10,89±2,5 |
18,07±0,7 |
|
Контрольная группа |
68,8ã6,1 |
10,2ã3,2 |
33,8±6,7 |
35,9±8,3 |
1,0±0,5 |
13,6±5,1 |
15,0±6,1 |
|
|
Референтные границы нормы |
58-85 |
10-23 |
35-50 |
25-35 |
1,5-2,0 |
5-10 |
8-19 |
|
|
(от производителя) |
*среднее содержание и его средняя квадратическая ошибка
Увеличилось и содержание натуральных киллеров CD16Á56 на 7-й день забора в сравнении с 5-м днем (13,93Ã1,8 и 8,27Ã1,5).
Однако, в целом следует отметить, что все показатели клеточного звена иммунитета испытуемых входили в референтные границы нормы
Определение Т регуляторной популяции лимфоцитов
Результаты определения Т регуляторной популяции лимфоцитов приведены в таблице 2.
Среднее содержание Т регуляторных лимфоцитов за весь период обследования в группах первично вакцинированных и вакцинированных повторно достоверно не различалось (0,50Ã0,06¿ и 0,39Ã0,03¿ соответственно). У первично вакцинированных наибольшее содержание Т регуляторных лимфоцитов отмечено на второй день после вакцинации, а наименьшее – на 7-9 день после вакцинации, у ревакцинированных на 13-14 и 7-9 день соответственно. Значимого влияния вакцинации на содержание Т регуляторных популяций лимфоцитов не обнаружено.
Таблица 2 - Определение Т регуляторных лимфоцитов
Определение антигенспецифических популяций лимфоцитов
Содержание ЛфР к F1приведено в таблице 3, а ЛфР к ЛПС – в таблице 4. Динамика их содержания приведена на рисунке.
Как видно из таблиц 3 и 4, до вакцинации ЛФР к F1 и ЛПС не обнаружены ни у одного из 13 обследованных людей, хотя 7 из них были вакцинированы ранее (не менее, чем за год до настоящей вакцинации). После вакцинации ЛФР к F1 и ЛПС выявлены у всех вакцинированных людей. Обнаружено различие в динамике ЛфР у людей, вакцинированных первый раз и вакцинированных повторно. В группе первично вакцинированных ЛфР к F1 на второй день после вакцинации обнаружены только у 4 из 6 вакцинированных (их среднее содержание составило 4,14Ã2,03¿), а у вакцинированных повторно – у всех 7 человек и их среднее содержание было достоверно (Р<0.05) более высоким (12,27Ã1,81¿). Аналогичная картина отмечена при выявлении ЛфР к ЛПС: у первично вакцинированных среднее содержание ЛфР к ЛПС было 6,02Ã1,85¿, а у вакцинированных повторно – значимо больше, 15,84Ã1,03¿. На 13-14 день после вакцинации среднее содержание ЛфР к F1 в группе первично вакцинированных было достоверно большим, чем в группе повторно вакцинированных людей (3,91Ã0,541 и 2,53Ã0,47¿ соответственно, Р<0,05)). Среднее содержание ЛфР к ЛПС в этот срок в обеих группах практически не различалось (4,05 и 4,14¿ соответственно). В цело среднее содержание ЛфР и к F1 и к ЛПС у вакцинированных повторно было большим, чем при первичной вакцинации. Это хорошо видно на рисунке. Также следует отметить, что содержание ЛфР к ЛПС, как в группе первично вакцинированных, так и в группе вакцинированных повторно было существенно большим, чем ЛфР к F1.
Начиная с 20-21 дня после вакцинации ЛфР обеих специфичностей не определялись.
|
Вакцина ция |
Количеств о люде й |
Относительное количество лимфоцитов (CD4+CD25+FoxP3á) от всех ядросодержащих клеток и его средняя квадратическая ошибка, ¿ |
|||||||
|
До вакцинац ии |
После вакцинации (дни) |
||||||||
|
2 |
4-6 |
7-9 |
13-14 |
20-21 |
28 |
35 |
|||
|
Первичн |
6 |
0,57±0,11 |
0,87±0, |
0,25±0, |
0,17±0, |
0,68±0, |
0,63±0,2 |
0,45±0, |
0, |
|
ая |
25 |
06 |
02 |
20 |
2 |
11 |
38±0,08 |
||
|
Повторна |
7 |
0,59ã0,05 |
0,59±0, |
0,16±0, |
0,13±0, |
0,61±0, |
0,33±0,0 |
0,56±0, |
0,19±0, |
|
я |
09 |
02 |
02 |
11 |
07 |
04 |
03 |
||
Таблица 3 - Динамика ЛфР к F1 антигену
|
№ вак- цини- руе- мо- го |
Кратность вакцинации |
Количество ЛфР к F1 и его средняя квадратическая ошибка, в % |
|||||
|
До вакцинации |
после вакцинации на |
||||||
|
2 день |
4-6 день |
7-9 день |
13-14 день |
20-21 день |
|||
|
1 |
повторная |
0,14±0,14 |
6,43±0,30 |
6,71±0,18 |
19,0±0,31 |
0,14±0,14 |
0,29±0,18 |
|
2 |
первичная |
0,43±0,20 |
0,14±0.14 |
11,71±0,29 |
14,00±0,22 |
2,29±0,18 |
0,43±0,20 |
|
3 |
повторная |
0,71±0,18 |
18,29±0,47 |
6,29±0,29 |
5,86±0,14 |
3,86±0,22 |
0,14±0,14 |
|
4 |
первичная |
0,29±0,18 |
4,00±0,22 |
13,57±0,37 |
9,29±0,29 |
3,29±0,18 |
0,14±0,14 |
|
5 |
повторная |
0,29±0,18 |
15,29±0,18 |
15,86±0,14 |
9,71±0,36 |
1,71±0,18 |
0±0 |
|
6/1 |
первичная |
0,28±0,18 |
0,43±0,20 |
10,86±0,71 |
11,43±0,20 |
3,91±0,41 |
0,14±0,14 |
|
7/2 |
повторная |
0,14±0,14 |
5,57±0,24 |
6,43±0,24 |
15,28±0,18 |
3.29±0,18 |
0,43±0,20 |
|
8/3 |
повторная |
0,14±0,14 |
15,43±0,38 |
15,43±0,28 |
9,86±0,34 |
2.71±0,20 |
0,14±0,14 |
|
9/4 |
первичная |
0,43±0,20 |
13,71±0,18 |
16,00±0,24 |
10,43±0,24 |
4,57±0,20 |
0±0 |
|
10/5 |
повторная |
0,14±0,14 |
11,29±0,24 |
13,14±0,28 |
11,71±0,20 |
3,14±0,14 |
0,14±0,14 |
|
11/6 |
первичная |
0±0 |
2,57±0,20 |
11,57±0,20 |
10,57±0,24 |
5,14±0,14 |
0±0 |
|
12/7 |
первичная |
0±0 |
4,00±0,24 |
12,71±0,24 |
11,28±0,18 |
4,29±0,18 |
0±0 |
|
13/8 |
повторная |
0,14±0,14 |
13,57±0,20 |
14,71±0,18 |
12,43±0,20 |
2,86±,14 |
0±0 |
Таблица , 4 - Динамика ЛфР к ЛПС
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Проведенные исследования не выявили какого-либо значимого влияния вакцинации людей ЖЧВ на динамику содержания основных популяций лимфлоцитов, включая Т - регуляторные лимфоциты. Это обуславливает необходимость продолжения таких исследований, особенно при сочетанном использовании ЖЧВ и иммуномодуляторов.
В то же время впервые описана динамика антигенспецифических популяций лимфоцитов периферической крови при вакцинации людей ЖЧВ. Показано, что динамика содержания ЛфР зависит от кратности вакцинации и их специфичности.
Полученные данные показали, что антигенспецифический клеточный ответ при повторной вакцинации развивается быстрее, чем при первичной вакцинации. Как было показана в эксперименте на кроликах, иммунизированных живой чумной вакциной, более короткая начальная стадия иммунного ответа, усиливает эффекторную стадию иммунного ответа, то есть способствует более раннему и более интенсивному образованию специфических антител [7]. В дальнейшем мы планируем оценить влияние начальной стадии иммунного ответа у вакцинированных людей на показатели эффекторной стадии.
|
№ вак- цини- руе- мого |
Кратность вакцинации |
Количество ЛфР к ЛПС и его средняя квадратическая ошибка, в ¿ |
|||||
|
До вакцинации |
после вакцинации через |
||||||
|
2 дня |
4-6 дней |
7-9 дней |
13-14 дней |
20-21 дней |
|||
|
1 |
повторная |
0.14ã0.14 |
18.0ã0.31 |
18.71ã0.36 |
19.14ã0.34 |
16.28ã0.32 |
0.14ã0.14 |
|
2 |
первичная |
0.43ã0.20 |
2.57ã0.20 |
14.86ã0.26 |
14.14ã0.0.14 |
4.86ã0.22 |
0.29ã0.18 |
|
3 |
повторная |
0.71ã0.20 |
19.14ã0.34 |
6.71ã0.18 |
6.00ã0.22 |
1.71ã0.20 |
0ã0 |
|
4 |
первичная |
0.29ã0.18 |
6.29ã0.29 |
15.57ã0.20 |
6.57ã0.20 |
2.14ã0.14 |
0ã0 |
|
5 |
повторная |
0.43ã0.20 |
15.29ã0.29 |
16.14ã0.34 |
11.29ã0.36 |
0.86ã0.14 |
0ã0 |
|
6/1 |
первичная |
0.28ã0.18 |
2.71ã0.18 |
12.86ã0.31 |
11.29ã0.18 |
3.43ã0.20 |
0.14ã0.14 |
|
7/2 |
повторная |
0.28ã0.18 |
16.57ã0.20 |
16.43ã0.28 |
16.71ã0.24 |
2.43ã0.20 |
0.29ã0.18 |
|
8/3 |
повторная |
0.14ã0.14 |
15.57ã0.34 |
6.14ã0.34 |
11.29ã0.34 |
1.86ã0.14 |
0.43ã0.20 |
|
9/4 |
первичная |
0.43ã0,20 |
14.71ã0.28 |
17.29ã0.28 |
11.00ã0.24 |
4.28ã0.18 |
0.14ã0.14 |
|
10/5 |
повторная |
0ã0 |
1057ã0.20 |
14.00ã0.24 |
12.28ã0.18 |
3.14ã0.14 |
0.14ã0.14 |
|
11/6 |
первичная |
0.14ã0.14 |
3.86ã0.24 |
13.71ã0.24 |
10.43ã0.29 |
4.43ã0.20 |
0.14ã0.14 |
|
12/7 |
первичная |
0.29ã0.18 |
6.00ã0.24 |
14.86ã0.28 |
12.28ã0.18 |
5.14ã0.14 |
0.43ã0.20 |
|
13/8 |
повторная |
0.14ã0.14 |
15.71ã0.18 |
16.29ã0.24 |
12.29ã0.18 |
2.71ã0.18 |
0.14ã0.14 |
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Л.А. Бурделов Атлас распространения особо опасных инфекций в Республике Казахстан. - Алматы: 2012. - 232 с.
- Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина. - М.: Медгиз, 1956. - 207 с.
- Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. - Саратов: 1992. - 172 с.
- Annacker, O. On the ontogeny and phisiology of regulatory T cells // Immunol. Rev. - 2001. - V. 182. - P. 5-17.
- Железникова Г.Ф. Регуляторные Т-лимфоциты в иммунном ответе на инфекцию // Журнал инфектологии. - 2011. - Том 3. - № 1. - С. 6-13.
- Karalnik B.V., Denisova T.G. Immunomodulation and stages of antigen specific response on herpes antigens // Medimond International proceedings. - 2011. - №3. - Р. 231 -235.
- Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Денисова Т.Г., Тугамбаев Т.И., Атшабар Б.Б., Закарян С.Б., Мельникова Н.Н. Влияние беталейкина на показатели антигенспецифического ответа в модельных опытах иммунизации животных живой чумной вакциной // Цитокины и воспаление. - 2014. - Т.13. - №1. - С. 57-62.