Динамика антигенспецифических и регуляторных популяций лимфоцитов у людей, иммунизированных живой чумной вакциной

Иммунофенотипирование основных популяций лимфоцитов и определение содержания Т регуляторных лимфоцитов и лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis у людей, иммунизированных живой чумной вакциной.

Обследовали 13 здоровых взрослых людей, иммунизированных живой чумной вакциной EV. 6 человек были вакцинированы первично, 7 человек - повторно (не ранее чем через 1 год после предыдущей вакцинации). Вакцинацию проводили методом скарификации, одна доза вакцины содержала 3 х109 живых микробных клеток. Кровь для исследования брали из локтевой вены до вакцинации и на 2, 4-6, 7-9, 13-14, 20-21, 27, 34, 48 и 62 дни после вакцинации.

Основные популяции лимфоцитов (CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, HLA-DR) и Т- регуляторные лимфоциты CD4/CD25/FoxP3) определяли при помощи лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител , используя “двойную метку, на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickenson, USA) в программе CellQuest. Полученные результаты сравнивали с данными, полученными в контрольной группе (50 условно здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет) и референтными границами нормы от производителя моноклональных антител. Содержание лимфоцитов с рецепторами (ЛфР) к капсульному антигену (F1) и ЛПС Y. pestis определяли в реакции адгезии к лимфоцитам иммунореагентов и, полученных нами конъюгацией F1 и ЛПС c эритроцитами быка, фиксированными ацетальдегидом. Параллельно выполняли такие анализы с контрольным реагентом - эритроцитами, не нагруженными антигенами Y. pestis.

Показано, что содержание основных популяций лимфоцитов (CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, HLA-DR) у всех обследованных людей, вакцинированных живой чумной вакциной, не выходило за пределы определенных норм и практически не изменялось в динамике. Среднее содержание Т –регуляторных лимфоцитов в группах первично и повторно вакцинированных также достоверно не различалось

ЛфР к антигенам Y. pestis не обнаружены до вакцинации и выявлены у же на 2-ой день после вакцинации. С 20-го дня ЛфР к антигенам Y. pestis не определялись. Следует отметить, что содержание лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis на 2-ой день после вакцинации в группе первично вакцинированных было существенно меньше, чем в группе вакцинированных повторно, а на 13-14 день – наоборот достоверно больше.

Таким образом, можно отметить, что кратность иммунизации живой чумной вакциной влияла на содержание и динамику лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis: при ревакцинации ЛфР появлялись в периферической крови раньше и раньше исчезали, чем при первичной вакцинации.

ВВЕДЕНИЕ. Чума была и остается одним из самых опасных инфекционных заболеваний. Природные очаги чумы занимают уже более 40¿ территории Казахстана [1]. Для профилактики чумы в Казахстане проводят вакцинацию людей, живущих или работающих в природных очагах чумы, и специалистов, работающих в противочумных организациях. В качестве вакцины используется живая чумная вакцина на основе штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ [2]. Несмотря на то, что эта вакцина применяется уже более 50 лет, иммунный ответ на эту вакцину характеризуются преимущественно лишь по определению активности антител к различным антигенам чумного микроба [2,3].

Регуляторные Т лимфоциты контролируют воспалительные реакции и специфический иммунный ответ на внедрение инфекции [4,5] Эти клетки экспрессируют FOXP3 — транскрипционный фактор, регулирующий транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвующих в супрессии иммунного ответа. Часто эти клетки так и обозначают, как FOXP3Á регуляторные Т-клетки (FOXP3Á Treg cells). Кроме того, важным маркером Т-регуляторных клеток является экспрессия на их поверхности рецептора к цитокину IL-2 — CD25, соответственно это обозначают как CD25Á клетки. Помимо этих основных маркёров Treg клетки на своей мембране экспрессируют CD62L, различные изоформы мембрано-связанной фосфатазы CD45. Различают несколько разных типов регуляторных Т-клеток: естественные Т-регуляторные клетки (T-reg1) и индуцибельные Т-регуляторные клетки (iT-reg). Индуцибельные Т-регуляторные клетки образуются под влиянием различных факторов на периферии, например, в региональных лимфатических узлах. При прямом механизме супрессии Treg взаимодействуют с эффекторными Т-клетками и гранзим B действует через перфорины, образующие канал, вызывая апоптоз в этих клетках, тем самым элиминируя активные Т-клетки. Содержание регуляторных Т лимфоцитов при вакцинации людей живой чумной вакциной не изучалось.

Известно, что иммунный ответ на вакцинацию имеет две стадии своего развития: начальную, характеризующуюся образованием популяций лимфоцитов, имеющих рецепторы к определенным антигенам, и эффекторную, характеризующуюся образованием антител соответствующей специфичности [6]. Как уже говорилось выше, эффекторная стадия иммунного ответа на живую

Таблица 1 - Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов периферической , крови вакцинированных людей чумную вакцину изучена хорошо. Исследования же начальной стадии - практически отсутствуют.

ЦЕЛЬ. Иммунофенотипирование основных популяций лимфоцитов и определение содержания Т регуляторных лимфоцитов и лимфоцитов с рецепторами к антигенам Y. pestis у людей, иммунизированных живой чумной вакциной.

МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ

Обследовали 13 здоровых взрослых людей, иммунизированных живой чумной вакциной EV. 6 человек были вакцинированы первично, 7 человек - повторно (не менее чем через 1 год после предыдущей вакцинации). Вакцинацию проводили методом скарификации, одна доза вакцины содержала 3 х109 живых микробных клеток. Кровь для исследования брали из локтевой вены до вакцинации и на 2, 4-6,7-9,13-14, 20-21, 27, 34, 48 и 62 после вакцинации. Все вакцинированные люди относились к декретируемому контингенту лиц, подлежащих вакцинации против чумы, и дали добровольное информированное согласие на использование данных их обследования в научных публикациях

Определение основных популяций лимфоцитов (CD3, CD19, CD4, CD8, CD16+56, HLA-DR), маркеры Т- регуляторных лимфоцитов CD4/CD25/FoxP3) проводили при помощи лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител, используя “двойную метку”: два типа моноклональных антител, несущих на себе различные красители (FITC - флюорисцеин-5- изотиоцонат и PE - фикоэритрин). Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickenson, USA) в программе CellQuest. Полученные результаты сравнивали с данными, полученными в контрольной группе (50 условно здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет) и референтными границами нормы от производителя моноклональных антител.

Содержание лимфоцитов с рецепторами (ЛфР) к антигенам Y. pestis F1 и ЛПС определяли в реакции адгезии к лимфоцитам иммунореагентов и, полученных нами конъюгацией F1 при помощи риванола и ЛПС без посредников c эритроцитами быка, фиксированными ацетальдегидом, как описано ранее [7]. Параллельно выполняли такие анализы с контрольным реагентом -эритроцитами, не нагруженными антигенами Y. pestis.

В работе применяли статистические методы частных сравнений серий. Результат считали значимым при Р≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипирование основных популяций лимфоцитов

Результаты фенотипирования основных популяций лимфоцитов приведены в таблице 1.

Выявлено достоверное увеличение содержания активированных CD19 лимфоцитов на 8-й день взятия крови по сравнению с 7-м днем (15,62Ã1,4 и 11,01Ã1,4), а также в сравнении с контрольной группой (10,2Ã3,2). Признаком активации является экспрессия молекулы HLA-DR на В- лимфоцитах. Их содержание достоверно увеличилось на 8-й день. Достоверное увеличение экспрессии CD8 лимфоцитов выявлено на 7-й день тестирования в сравнении с 4-м днем (34,54Ã1,7 и 26,79Ã2,1). Это повлияло на сдвиг в соотношении субпопуляций CD4/CD8, вследствие чего, ИРИ снизился с 1,8Ã0,3 до 1,2Ã0,1. Достоверной разницы с группой контроля по этим показателям не выявлено.

Сроки обследов ания (день после вакцина ции)

Число обследованных

Содержание лимфоцитов

соответствующей

*, %

популяции

Соотношение содержания,

ИРИ*, CD4/CD8

Содержание соответствующей популяции лимфоцитов*, ¿

CD3+

CD19+

CD4+

CD8+

CD16+56+

HLA-DR

0

13

69,76±1,7

13,05±1,6

40,15±1,7

31,14±0,95

1,3±0,1

11,68±2,0

15,64±1,6

2

13

71,75ã1,2

13,43ã1,2

43,29±1,5

29,50±1,2

1,6±0,1

9,35±1,3

15,94±1,2

4-6

13

70,94ã1,2

13,65ã1,2

42,18±1,6

28,66±1,4

1,5±0,1

10,59±1,5

15,52±1,3

7-9

13

71,17ã1,1

13,25ã1,6

42,96±2,4

26,79±2,1

1,8±0,3

10,93±2,4

14,87±1,2

13-14

13

72,68ã1,4

13,18ã0,9

45,05±3,2

27,50±2,1

1,7±1,2

8,27±1,5

13,04±0,6

20-21

13

70,01ã1,5

12,75ã1,2

40,88±2,2

33,87±2,0

1,3±0,1

9,56±1,2

14,55±1,4

28

13

69,25ã1,8

11,01ã1,4

39,59±2,2

34,54±1,7

1,2±0,1

13,93±1,8

14,22±1,8

35

13

67,00ã2,2

15,62ã1,4

39,23±2,7

31,58±1,6

1,3±0,2

10,89±2,5

18,07±0,7

Контрольная группа

68,8ã6,1

10,2ã3,2

33,8±6,7

35,9±8,3

1,0±0,5

13,6±5,1

15,0±6,1

Референтные границы нормы

58-85

10-23

35-50

25-35

1,5-2,0

5-10

8-19

(от

производителя)

             

*среднее содержание и его средняя квадратическая ошибка

Увеличилось и содержание натуральных киллеров CD16Á56 на 7-й день забора в сравнении с 5-м днем (13,93Ã1,8 и 8,27Ã1,5).

Однако, в целом следует отметить, что все показатели клеточного звена иммунитета испытуемых входили в референтные границы нормы

Определение Т регуляторной популяции лимфоцитов

Результаты определения Т регуляторной популяции лимфоцитов приведены в таблице 2.

Среднее содержание Т регуляторных лимфоцитов за весь период обследования в группах первично вакцинированных и вакцинированных повторно достоверно не различалось (0,50Ã0,06¿ и 0,39Ã0,03¿ соответственно). У первично вакцинированных наибольшее содержание Т регуляторных лимфоцитов отмечено на второй день после вакцинации, а наименьшее – на 7-9 день после вакцинации, у ревакцинированных на 13-14 и 7-9 день соответственно. Значимого влияния вакцинации на содержание Т регуляторных популяций лимфоцитов не обнаружено.

Таблица 2 - Определение Т регуляторных лимфоцитов

 Определение антигенспецифических популяций лимфоцитов

Содержание ЛфР к F1приведено в таблице 3, а ЛфР к ЛПС – в таблице 4. Динамика их содержания приведена на рисунке.

Как видно из таблиц 3 и 4, до вакцинации ЛФР к F1 и ЛПС не обнаружены ни у одного из 13 обследованных людей, хотя 7 из них были вакцинированы ранее (не менее, чем за год до настоящей вакцинации). После вакцинации ЛФР к F1 и ЛПС выявлены у всех вакцинированных людей. Обнаружено различие в динамике ЛфР у людей, вакцинированных первый раз и вакцинированных повторно. В группе первично вакцинированных ЛфР к F1 на второй день после вакцинации обнаружены только у 4 из 6 вакцинированных (их среднее содержание составило 4,14Ã2,03¿), а у вакцинированных повторно – у всех 7 человек и их среднее содержание было достоверно (Р<0.05) более высоким (12,27Ã1,81¿). Аналогичная картина отмечена при выявлении ЛфР к ЛПС: у первично вакцинированных среднее содержание ЛфР к ЛПС было 6,02Ã1,85¿, а у вакцинированных повторно – значимо больше, 15,84Ã1,03¿. На 13-14 день после вакцинации среднее содержание ЛфР к F1 в группе первично вакцинированных было достоверно большим, чем в группе повторно вакцинированных людей (3,91Ã0,541 и 2,53Ã0,47¿ соответственно, Р<0,05)). Среднее содержание ЛфР к ЛПС в этот срок в обеих группах практически не различалось (4,05 и 4,14¿ соответственно). В цело среднее содержание ЛфР и к F1 и к ЛПС у вакцинированных повторно было большим, чем при первичной вакцинации. Это хорошо видно на рисунке. Также следует отметить, что содержание ЛфР к ЛПС, как в группе первично вакцинированных, так и в группе вакцинированных повторно было существенно большим, чем ЛфР к F1.

Начиная с 20-21 дня после вакцинации ЛфР обеих специфичностей не определялись.

Вакцина ция

Количеств о люде й

Относительное количество лимфоцитов (CD4+CD25+FoxP3á) от всех ядросодержащих клеток и его средняя квадратическая ошибка, ¿

До вакцинац ии

После вакцинации (дни)

2

4-6

7-9

13-14

20-21

28

35

Первичн

6

0,57±0,11

0,87±0,

0,25±0,

0,17±0,

0,68±0,

0,63±0,2

0,45±0,

0,

ая

   

25

06

02

20

2

11

38±0,08

Повторна

7

0,59ã0,05

0,59±0,

0,16±0,

0,13±0,

0,61±0,

0,33±0,0

0,56±0,

0,19±0,

я

   

09

02

02

11

07

04

03

Таблица 3 - Динамика ЛфР к F1 антигену

№ вак- цини-

руе- мо-

го

Кратность вакцинации

Количество ЛфР к F1 и его средняя квадратическая ошибка, в %

До вакцинации

после вакцинации на

2 день

4-6 день

7-9 день

13-14 день

20-21 день

1

повторная

0,14±0,14

6,43±0,30

6,71±0,18

19,0±0,31

0,14±0,14

0,29±0,18

2

первичная

0,43±0,20

0,14±0.14

11,71±0,29

14,00±0,22

2,29±0,18

0,43±0,20

3

повторная

0,71±0,18

18,29±0,47

6,29±0,29

5,86±0,14

3,86±0,22

0,14±0,14

4

первичная

0,29±0,18

4,00±0,22

13,57±0,37

9,29±0,29

3,29±0,18

0,14±0,14

5

повторная

0,29±0,18

15,29±0,18

15,86±0,14

9,71±0,36

1,71±0,18

0±0

6/1

первичная

0,28±0,18

0,43±0,20

10,86±0,71

11,43±0,20

3,91±0,41

0,14±0,14

7/2

повторная

0,14±0,14

5,57±0,24

6,43±0,24

15,28±0,18

3.29±0,18

0,43±0,20

8/3

повторная

0,14±0,14

15,43±0,38

15,43±0,28

9,86±0,34

2.71±0,20

0,14±0,14

9/4

первичная

0,43±0,20

13,71±0,18

16,00±0,24

10,43±0,24

4,57±0,20

0±0

10/5

повторная

0,14±0,14

11,29±0,24

13,14±0,28

11,71±0,20

3,14±0,14

0,14±0,14

11/6

первичная

0±0

2,57±0,20

11,57±0,20

10,57±0,24

5,14±0,14

0±0

12/7

первичная

0±0

4,00±0,24

12,71±0,24

11,28±0,18

4,29±0,18

0±0

13/8

повторная

0,14±0,14

13,57±0,20

14,71±0,18

12,43±0,20

2,86±,14

0±0

Таблица , 4 - Динамика ЛфР к ЛПС

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенные исследования не выявили какого-либо значимого влияния вакцинации людей ЖЧВ на динамику содержания основных популяций лимфлоцитов, включая Т - регуляторные лимфоциты. Это обуславливает необходимость продолжения таких исследований, особенно при сочетанном использовании ЖЧВ и иммуномодуляторов.

В то же время впервые описана динамика антигенспецифических популяций лимфоцитов периферической крови при вакцинации людей ЖЧВ. Показано, что динамика содержания ЛфР зависит от кратности вакцинации и их специфичности.

Полученные данные показали, что антигенспецифический клеточный ответ при повторной вакцинации развивается быстрее, чем при первичной вакцинации. Как было показана в эксперименте на кроликах, иммунизированных живой чумной вакциной, более короткая начальная стадия иммунного ответа, усиливает эффекторную стадию иммунного ответа, то есть способствует более раннему и более интенсивному образованию специфических антител [7]. В дальнейшем мы планируем оценить влияние начальной стадии иммунного ответа у вакцинированных людей на показатели эффекторной стадии.

№ вак- цини- руе- мого

Кратность вакцинации

Количество ЛфР к ЛПС и его средняя квадратическая ошибка, в ¿

До вакцинации

после вакцинации через

2 дня

4-6 дней

7-9 дней

13-14 дней

20-21 дней

1

повторная

0.14ã0.14

18.0ã0.31

18.71ã0.36

19.14ã0.34

16.28ã0.32

0.14ã0.14

2

первичная

0.43ã0.20

2.57ã0.20

14.86ã0.26

14.14ã0.0.14

4.86ã0.22

0.29ã0.18

3

повторная

0.71ã0.20

19.14ã0.34

6.71ã0.18

6.00ã0.22

1.71ã0.20

0ã0

4

первичная

0.29ã0.18

6.29ã0.29

15.57ã0.20

6.57ã0.20

2.14ã0.14

0ã0

5

повторная

0.43ã0.20

15.29ã0.29

16.14ã0.34

11.29ã0.36

0.86ã0.14

0ã0

6/1

первичная

0.28ã0.18

2.71ã0.18

12.86ã0.31

11.29ã0.18

3.43ã0.20

0.14ã0.14

7/2

повторная

0.28ã0.18

16.57ã0.20

16.43ã0.28

16.71ã0.24

2.43ã0.20

0.29ã0.18

8/3

повторная

0.14ã0.14

15.57ã0.34

6.14ã0.34

11.29ã0.34

1.86ã0.14

0.43ã0.20

9/4

первичная

0.43ã0,20

14.71ã0.28

17.29ã0.28

11.00ã0.24

4.28ã0.18

0.14ã0.14

10/5

повторная

0ã0

1057ã0.20

14.00ã0.24

12.28ã0.18

3.14ã0.14

0.14ã0.14

11/6

первичная

0.14ã0.14

3.86ã0.24

13.71ã0.24

10.43ã0.29

4.43ã0.20

0.14ã0.14

12/7

первичная

0.29ã0.18

6.00ã0.24

14.86ã0.28

12.28ã0.18

5.14ã0.14

0.43ã0.20

13/8

повторная

0.14ã0.14

15.71ã0.18

16.29ã0.24

12.29ã0.18

2.71ã0.18

0.14ã0.14

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Л.А. Бурделов Атлас распространения особо опасных инфекций в Республике Казахстан. - Алматы: 2012. - 232 с.
  2. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина. - М.: Медгиз, 1956. - 207 с.
  3. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. - Саратов: 1992. - 172 с.
  4. Annacker, O. On the ontogeny and phisiology of regulatory T cells // Immunol. Rev. - 2001. - V. 182. - P. 5-17.
  5. Железникова Г.Ф. Регуляторные Т-лимфоциты в иммунном ответе на инфекцию // Журнал инфектологии. - 2011. - Том 3. - № 1. - С. 6-13.
  6. Karalnik B.V., Denisova T.G. Immunomodulation and stages of antigen specific response on herpes antigens // Medimond International proceedings. - 2011. - №3. - Р. 231 -235.
  7. Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Денисова Т.Г., Тугамбаев Т.И., Атшабар Б.Б., Закарян С.Б., Мельникова Н.Н. Влияние беталейкина на показатели антигенспецифического ответа в модельных опытах иммунизации животных живой чумной вакциной // Цитокины и воспаление. - 2014. - Т.13. - №1. - С. 57-62.
Год: 2016
Город: Алматы
Категория: Медицина