Анализ цитокинового статуса у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени вирусной этиологии

Исследование направлено на анализ цитокинов ИЛ-1ß, ИЛ-10, ИЛ-17А у больных циррозом печени вирусной этиологии и хроническим вирусным гепатитом. Всего в исследовании приняло участие 211 человек. Из них 65 с диагнозом цирроз печени вирусной этиологии, 57 с хроническим вирусным гепатитом и 89 человек контрольной группы. Определение цитокинов проводили методом иммуноферментного анализа. В проведенном нами исследовании установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени отмечается гипопродукция провоспалительного цитокина ИЛ-17А по сравнению с контрольной группой. Так же гипопродукция цитокина KA-1βу больных хроническим вирусным гепатитом по сравнению с контрольной группой.

Введение. Вирусные гепатиты являются важной социальной и медицинской проблемой. Наибольшую опасность представляют парентеральные вирусные гепатиты B и C вследствие высокой степени хронизации и вероятностью перехода процесса в конечные стадии – цирроз печени или гепатоцеллюлярную карциному [1,2]. Исходы хронических вирусных гепатитов зависят от иммунного ответа [3]. Цитокины являются ключевыми медиаторами воспалительного процесса и формирования специфического иммунитета, ответственного за естественную элиминацию вируса гепатита [4]. У больных хроническим вирусным гепатитом (ХВГ) отмечается взаимосвязь с соотношением цитокинов. В отечественных и зарубежных исследованиях показана роль цитокинов в контроле вирусной репликации [5], процессов повреждений гепатоцитов и воспалительной инфильтрации [6], регенерации и развитие фиброза печени [7]. Вирусы гепатита В и С инфицируют не только гепатоциты, но и другие клетки-мишени, в частности клетки иммунной системы — лимфоциты, что приводит к угнетению их функциональных возможностей и длительной персистенции вируса в организме [8]. Установлено, что инфицирование вирусами гепатита приводит к активации Т-хелперов 1-го и 2-го типов (Th-1,Th-2), соотношение которых, на ранних стадиях может определят исход заболевания [9]. Так же учеными установлено, что при прогрессировании хронического вирусного гепатита в цирроз печени, повышается уровень противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10) и снижается уровень провоспалительных (ИЛ-1В, ИЛ-17А) [10].

К одним из представителей провоспалительных цитокинов относится интерлейкин 1β (ИЛ-1В). ИЛ-1 регулирует процессы воспаления и иммунитета [11]. Он синтезируется многими клетками организма, в первую очередь активированными макрофагами, в меньшей степени кератиноцитами, стимулированными B-лимфоцитами и фибробластами [12]. Клетками-мишенями действия ИЛ-1 являются миоциты, синовиоциты, гепатоциты, костные клетки, лимфоциты, нейроциты [13]. Доказано, что большую роль в развитии заболеваний печени играет ИЛ-1 [14]. Все провоспалительные цитокины являются взаимными индукторами: ИЛ- 1 усиливает продукцию самого ИЛ-1, а также интерлейкинов 6, 8 и ФНО-а. Последний, в свою очередь, индуцирует синтез интерлейкинов 1, 6 и 8 [15].

Интерлейкин-17 (ИЛ-17) так же относиться к семейству провоспалительных цитокинов, продуцируемых Т- хелперами 17 (Th17) [16], и играет важную роль в заболеваниях, ассоциированных с воспалением [17]. Th17- клетки вовлекаются в иммунный ответ при бактериальном заражении, а также патогенетически связаны с развитием хронических воспалительных процессов [18]. Как показывают последние исследования, Th17-клетки ассоциированы с хроническими заболеваниями печени [19], в том числе с хроническим вирусным гепатитом В, циррозом печени и гепатоцеллюлярной карциномой [20]. Было показано, что увеличение частоты встречаемости Th17- клеток в периферической крови и печени пациентов при хроническом вирусном гепатите В связано с повышением уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) [21].

Противовоспалительный цитокин интерлейкин-10 (ИЛ-10) играет важную роль в регуляции иммунного ответа, угнетает действие макрофагов и Th1-клеток и, соответственно, уменьшает цитотоксический ответ организма, а также способствует реализации биологических эффектов Th2- клеток, что обеспечивает развитие гуморальной составляющей иммунного ответа [22]. Отмечается увеличение концентрации ИЛ-10 при различных опухолях, при этом, высокая продукция ИЛ-10 ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и выраженной прогрессией опухолевого роста [23].

Цель исследования. Анализ уровня цитокинов ИЛ-1ß, ИЛ- 10, ИЛ-17А у больных циррозом печени вирусной этиологии и хроническим вирусным гепатитом.

Материалы и методы. В исследовании случай-контроль [24, 25], всего приняло участие 211 человек, в возрасте от 18 до 80 лет. Из них 65 пациентов с ЦП вирусной этиологии и 57 с ХВГ, состояли на учете в Гепатологическом центре г. Семей с установленным и подтвержденным диагнозом. В контрольной группе 89 донора, HBV- и HCV-отрицательны. Половозрастные характеристики приведены в таблице 1. Обследование на наличие или отсутствие хронического вирусного гепатита проводили согласно Приказу и. о. Министра здравоохранения Республики Казахстан от 17 февраля 2012 года № 92 «Об утверждении Правил обследования и лечения больных вирусными гепатитами».

Таблица 1 – Распределение больных циррозом печени вирусной этиологии, хроническим вирусным гепатитом и контрольной группы по полу и возрасту

Исследование отвечает требованиям Хельсинской декларации, Всемирной Медицинской Ассоциации (http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/) и одобрено этическим комитетом Государственного Медицинского Университета г. Семей, протокол №2 от 13.11.2013г. Все участники исследования были информированы о целях исследования и предстоящих процедурах, у всех было получено информированное письменное согласие на участие в исследовании.

Для исследования использовалась периферическая кровь в 5 мл пробирки с ЭДТА. Определение цитокинов методом твердофазного ИФА проводилось на базе Объединенной учебно-научной лаборатории Государственного медицинского университета г. Семей: ИЛ-1ß, ИЛ-10, ИЛ-17. Исследование цитокинов проводилось методом иммуноферментного определения концентрации интерлейкинов при помощи коммерческой тест-системы «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) с использованием иммуноферментного анализатора ПИКОН (PICON Incorporated Co, Россия) в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для анализа количественных признаков [24] при сравнении двух независимых выборок применяли непараметрический критерий Манна–Уитни [26], при сравнении трех и более выборок — Н-критерий Краскеля–Уолесса [27], предварительно проверив на нормальность распределения выборки с помощью критерия Шапиро-Уилка. Различия между выборками считались статистически достоверными при значении для p < 0,05. Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS для Windows, версии 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

№1-2016 · KaзH МУ • kaznm∪.kz

Результаты исследования. Сравнение трех групп по возрасту выявило статистически значимую разницу. Возраст пациентов с циррозом печени был значимо старше (50,8±10,7), чем пациентов с хроническим вирусным гепатитом (41,6±13,0 лет) и здоровых лиц (40,1±12,3 лет). Значимой разницы в возрасте между двумя последними группами не наблюдалось. Эти результаты, вероятно, указывают на то, что прогрессия вирусного гепатита к циррозу печени растянута во времени; в данном исследовании этот срок оказался равным около 9 годам. Средний уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-10 был снижен у больных циррозом печени вирусной этиологии, однако этот результат не достиг статистической значимости (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнение уровня цитокина ИЛ-10

* df - число степеней свободы

**р - достигнутый уровень статистической значимости

Содержание уровня ИЛ-1В, в значительной степени снижено у больных хроническим вирусным гепатитом в сравнении с контрольной группой, и достиг статистической значимости.

При сравнении цирроза печени и здоровых лиц, статистических значимых различий в содержании уровня ИЛ-1В нет.

Нами были выявлены статистически значимые различия по содержанию уровня ИЛ-17А у больных циррозом печени вирусной этиологии и у больных хронически вирусным гепатитом в сравнении с контрольной группой как показано в таблице 4.

Таблица 3 - Сравнение уровня цитокина ИЛ-1В

Таблица 4 - Сравнение уровня цитокина ИЛ-17А

Обсуждение. В проведенном нами исследовании мы получили снижение уровня цитокина ИЛ-17А у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени вирусной этиологии в сравнении с контрольной группой. По данным полученным нами при литературном поиске, было обнаружено увеличение уровня ИЛ-17А при хроническом вирусном гепатите В [28,29], и снижение при хроническом вирусном гепатите С [30]. В нашем исследовании мы объединили хронические вирусные гепатиты В и С в общую группу в виду схожести патогенеза хронических вирусных гепатитов, не разделяя на отдельные нозологии.

Установлено, что при прогрессировании хронического вирусного гепатита в цирроз печени, повышается уровень противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10) и снижается уровень провоспалительных (ИЛ-1В, ИЛ-17А) [31]. Mohammad Kazemi A и соавт., установили, что уровень ИЛ-10 повышается у больных хроническими вирусными гепатитами [28] и снижается у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой вирусной этиологии [32]. В нашем исследовании уровень интерлейкина -10 снижен у больных ХВГ и повышен у больных ЦП по сравнению с контрольной группой, однако статистически достоверной разницы во всех исследуемых группах не было. Это

возможно связано с относительно малой выборкой, что дает возможность для продолжения исследований в данном направлении с большим количеством обследуемых.

Содержание уровня цитокина ИЛ-1ß статистически достоверно снижено у больных ХВГ в сравнении с контрольной группой, и незначительно повышен у больных циррозом печени, однако статистической значимости этот результат не достиг. Это может так же означать, что провоспалительный цитокин ИЛ-1ß может влиять на течение болезни у наших больных, снижается при хроническом вирусном гепатите и повышается при прогрессировании в цирроз печени. Е.Л. Красавцев, в исследовании [33] показал, что уровень ИЛ-1ß повышается по мере прогрессирования хронического вирусного гепатита, что так же подтверждает нашу теорию.

Вывод. В проведенном нами исследовании установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени отмечается гипопродукция провоспалительного цитокина ИЛ-17А по сравнению с контрольной группой, так же гипопродукция цитокина ИЛ-1ß у больных ХВГ по сравнению с контрольной группой.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Papatheodoridis G. V. et al. Barriers to care and treatment for patients with chronic viral hepatitis in Europe: a systematic review. //Liver International. – 2014. – 34 – №. 10. – P. 1452-1463.
2. Lazarus J. Global policy report on the prevention and control of viral hepatitis in WHO Member States. //World Health Organization,2014.
3. Арсентьева Н. А., Семенов А. В., Тотолян А. А. Роль полиморфизма генов цитокинов при вирусном гепатите С. //Инфекция и иммунитет. – 2012. – 2 – С. 687-698.
4. Семенов А. В., Арег А., Арсентьева Н. А. Роль полиморфизма генов цитокинов при вирусном гепатите С //Инфекция и иммунитет. – 2012. – Т. 2. – №. 4.
5. Маркелова Е. В., и др. Патогенетическая роль нарушений в системе цитокинов при инфекционно-воспалительных заболеваниях //Тихоокеанский медицинский журнал. – 2008. – Т. 3. – С. 24-9.
6. Симбирцев А. С. Цитокины: классификация и биологические функции //Журнал Цитокины и воспаление. – 2004. – №2. - С. 5-6.
7. Симбирцев А. С. Цитокиныновая система регуляции защитных реакций организма //Журнал Цитокины и воспаление. – 2002. – №1. - С. 3-5.
8. Мирхайдаров Р. Ш. и др. Особенности иммунного статуса больных хроническим вирусным гепатитом. //Геронтология. – 2015. – Т. 7. – С. 26..
9. Белобородова Э. И., Пузырев В. П. Анализ связи полиморфизма ILE50VAL гена рецептора интерлейкина-4 (IL4RA) c хроническим вирусным гепатитом. //Молекулярная биология. – 2005. – Т. 39. – №. 3.
10. Wang J, Ni H, Chen L, Song WQ. Interleukin-10 promoter polymorphisms in patients with hepatitis B virus infection or hepatocellular carcinoma in Chinese Han ethnic population. //Hepatobiliary Pancreat Dis Int. – 2006. – 5(60). P. 4.
11. Громова А. Ю., и др. Влияние функционального полиморфизма генов семейства интерлейкина-1 на предрасположенности и характер течения хронического гнойного риносинусита и эффективность терапии рекомбинантным интерлейкином-1 бета (беталейкин). //Российская оториноларингология. //Медицинский научно-практический журнал. – 2005. – 2 – С. 5–12.
12. Романова Е. С., Кузнецов Н. И., Старцева Г. Ю. Беталейкин В терапии хронического гепатита С. //Журнал инфектологии. – С. 27.
13. Саламатов А. В., и др. Эффективность рекомбинантного IL-1 бета в лечении гнойно-деструктивных заболеваний легких и плевры //Цитокины и воспаление. – 2006. – №5. – С. 39– 45.
14. Кляритская И. Л., Стилиди Е. И. Роль различных цитокинов в фиброгенезе печени при хронических вирусных гепатитах В и С. //Кримський терапевтичний журнал. – 2010. – №. 1. – С. 41-45.
15. Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю. Цитокины — общая система гомеостатической регуляции клеточных функций //Цитология.— 2001.— № 12.— С. 1110 – 1101.
16. Nordang G. B., Viken M. K., et al. Association analysis of the interleukin 17A gene in Caucasian rheumatoid arthritis patients from Norway and New Zealand. //Rheumatology (Oxford). — 2009. — 48 — P. 367–370.
17. Omrane I. et al. Significant association between interleukin-17A polymorphism and colorectal cancer. //Tumor Biology. — 2014. — 35(7) — P. 6627-6632.
18. Кологривова И. В., Кологривова Е. Н., Суслова Т. Е. Молекулярные аспекты функционирования Т-хелперов 17-го типа. //Бюллетень сибирской медицины. — 2011. — №4 — P. 93-99.
19. Zhang J. Y. et al. Interleukin‐17–producing CD4+ T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B. //Hepatology. — 2010. — 51(1) — P. 81-91.
20. Hu X. et al. Interleukin-21 is upregulated in hepatitis B-related acute-on-chronic liver failure and associated with severity of liver disease. //Journal of viral hepatitis. — 2011. — 18(7) — P. 458-467.
21. Wang X. et al. High-mobility group box 1 (HMGB1) -toll-like receptor (TLR) 4-interleukin (IL)-23-IL-17A axis in drug-induced damage-associated lethal hepatitis: Interaction of γδ T cells with macrophages. //Hepatology. — 2013. — 57(1) — P. 373-384.
22. Масабаева М. Р., Аукенов Н. Е., Бабенко Д. Б., Азизов И. С., и др. Оценка влияния полиморфизма гена IL10 на исходы хронических вирусных гепатитовв казахской популяции: исследование случай-контроль. //Наука и Здравоохранение. — 2015. — № 6 — С. 67-76.
23. Wang, S., Huang, D., Sun, S., Ma, W., & Zhen, Q. Interleukin-10 promoter polymorphism predicts initial response of chronic hepatitis B to interferon alpha. //Virology journal. — 2011 — 8.(28) — Р. 422.
24. Бекенова Н. Б., Гржибовский А. М., Муковозова Л. А. Содержание цитокинов у больных рожей //Наука и Здравоохранение. —
25. — № 6 — С. 55-66.
26. Гржибовский А. М. Иванов С. В., Горбатова М. А. Исследования типа «случай-контроль» в здравоохранении //Наука и Здравоохранение. — 2015. — № 4 — С. 5-17.
27. Гржибовский А. М. Анализ количест-венных данных для двух независимых групп // Экология человека. - 2008. - № 2. - С. 54-61.
28. Гржибовский А. М. Анализ трех и более независимых групп количественных данных // Экология человека. 2008. №. 3. С. 50-58.
29. Mohammad Kazemi A. et al. Serum levels of IL-10 and IL-17A in occult HBV-infected South-East Iranian patients //Hepatitis Monthly. - 2010. -№1, Winter. - Р. 31-35.
30. Wu W. et al. Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients //Journal of gastroenterology and hepatology. - 2010. - 25. - №4. - Р. 750-757.
31. Sousa G. M. et al. Serum levels of Th17 associated cytokines in chronic hepatitis C virus infection //Cytokine. - 2012. - Т. 60. - №1. - Р. 138-142.
32. Wang J, Ni H, Chen L, Song WQ. Interleukin-10 promoter polymorphisms in patients with hepatitis B virus infection or hepatocellular carcinoma in Chinese Han ethnic population. //Hepatobiliary Pancreat Dis Int. - 2006 - 5 - Р. 60-64.
33. Saxena R, Chawla YK, Verma I, Kaur J. Association of interleukin-10 with hepatitis B virus (HBV) mediated disease progression in Indian population. //Indian J. Med Res. - 2014. - 139 - Р. 737-745.
34. Красавцев Е. Л. Динамика уровня цитокинов у больных хроническим гепатитом С. //Проблемы здоровья и экологии. – 2009. – №. 2 (20) – С. 2-4.