Изучение антиокислительных свойств экстрактов из сухих листьев абрикоса armeniaca vulgaris l. различными методами

В статье приведены результаты исследования антиокислительных свойств сухого экстракта из листьев абрикоса обыкновенного. Доказано, что в различных модельных системах экстракты из сухих листьев абрикоса оказывают прямое антиоксидантное действие; этаноловый экстракт обладает более выраженным антиоксидантным действием по сравнению с раствором водного экстракта. Подавление свободно-радикального окисления имеет прямую зависимость от концентрации: чем выше концентрация, тем больше антиоксидантная активность (АОА). Особое влияние на величину АОА экстрактов оказывает содержание флавонолов. 

ВВЕДЕНИЕ.

Известно, что в развитии многих патохимических процессов организма определенную роль играют активные формы кислорода (АФК). Патогенетическая функция активных метаболитов кислорода и органических свободных радикалов идентифицирована более чем для 100 заболеваний человека и в различной степени присуща любым патологическим состояниям. Окислительный стресс является причиной или важной составляющей многих серьезных заболеваний у человека, таких как: нейродегенеративныe расстройствa, сердечно-сосудистые болезни, легочные расстройства, почечные расстройства, желудочно-кишечные заболевания, старение и др. [3, 8, 9, 10, 11].

Поиск новых источников антиоксидантов является актуальной задачей. Антиоксиданты предотвращают перекисное окисление липидов, угнетают и тормозят накопление свободных радикалов в организме и могут свести оксидантный стресс к минимуму, значительно снизить его проявления [12,14,15].

С этой точки зрения перспективным растением для Армении является абрикос обыкновенный (Armeniaca VulgarisL., сем. Rosacea). Опыт применения данного растения (плоды, семена, масло, камедь, листья) в народной медицине свидетельствует о широких терапевтических возможностях. В частности, листья абрикоса применялись при диарее, хронической интоксикации, ожогах, поносе, для лечения ссадин, трещин и ран кожных покровов, при стоматите, в качестве болеутоляющего при зубной боли, при дифтерии, а также при чесотке, экземе и т.д. [5,13].

Сухой экстракт из листьев абрикоса нормализует окислительные процессы в организме пораженных тетрахлорметаном животных, оказывает стабилизирующее влияние на плазматические мембраны гепатоцитов, проявляет гепатопротекторные свойства. Все это указывает на то, что экстракту присущи антиокислительные свойства [7].

Целью настоящей работы является изучение антиокислительных свойств водного и этанолового экстркатов из листьев абрикоса in vitro методами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Таблица 1 - Антиоксидантная активность экстрактов хемилюминесцентным методом из ЛСД и ЛМД (n=4, P<0,05)

Материалом исследования служили листья абрикоса обыкновенного сорта Еревани (Шалах), собранные с 20112014 г за 3 недели до достижения плодами технологической зрелости в зависимости от возраста дерева: листья молодых деревьев (ЛMД) - деревья младше 15 лет и листья старых деревьев (ЛСД) - деревья старше 15 лет. Свежие листья были фиксированы на паровой бане в течение 10 минут и высушены при комнатной темпeратуре до воздушно-сухого состояния, после чего упакованы в бумажные мешки, которые хранились в сухом прохладном месте. Для химического анализа среднюю пробу сырья измельчали до размера 1,0 мм.

Водный экстракт: точную навеску измельченного сырья (около 2 г) помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляли примерно 30 мл нагретой до кипения воды и кипятили с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Жидкость охлаждали до комнатной температуры и процеживали в 100 мл мерную колбу. Спиртовый экстракт: из средней пробы измельчённых листьев брали навеску 1г и заливали горячим 70° этиловым спиртом, кипятили на водяной бане с обратным холодильником 7-10 мин, охлаждали. Холодный раствор фильтровали. Экстракцию повторяли дважды. Объединённые экстракты вливали в 50 мл мерную колбу и доводили 70¿-ным спиртом до метки [1].

Также были определены содержания биологически активных веществ, в частности, витамина C, флавоноидов, дубильных вешеств [2].

Для оценки антиокислительных свойств экстрактов были использованы in vitro методы.

1. Вольтамперметрический метод проводился на анализаторе “Антиоксидант АОА-01” (Россия). В качестве фонового электролита для водных настоев был выбран фосфатный буфер (pH=6,86), для спиртовых - NaClO4 [6]. Антиоксидантная активность экстрактов сравнивалась с аналогичными показателями стандартных антиоксидантов - рутина, танина, витамина С.
2. Хемилюминесцентный метод. Определение проводилось на фотохемилюминесцентном анализаторе PHOTOCHEM (AnaliticJenaCo., Germany).
3. Перманганатометрический метод. Водными и спиртовыми извлечениями титруют раствор, состоящий из 8 мл свежепрокипячённой и охлаждённой дистиллированной воды, 1 мл 20¿ раствора серной кислоты, 1 мл 0,05н раствора KMnO4, и определяют антиоксидантную активность (АОА) экстрактов в пересчете на кверцетин [4].

Анализы выполняли в трех-пяти повторностях. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием программы Microsoft Office Excel 2007 программы ANOVA (метод парных сравнений, коэффициент корреляции, LSD). Результаты представлены в виде средних арифметических значений с указанием ошибки средней величины, коэффициента корреляции и критерия достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Определение АОА изучаемых экстрактов хемилюминесцентным методом.

В процессе работы использовали набор для определения антиоксидантной способности водорастворимых веществ ACW. В данном методе люминол играет роль не только фотосенсибилизатора, но и вещества-детектора свободных радикалов. Калибровка и измерение проводились в соответствии со стандартным протоколом ACW, установленным производителем.

Результаты рассчитывали в эквивалентах аскорбиновой кислоты (в микромолях) (таблица 1).

Выяснилось, что 10 мкл экстракта, приготовленного из листьев абрикоса (10:100), проявляли настолько высокую антиоксидантную активность, что сигнал не детектировался на анализаторе, т.е. не входил в диапазон измерения. При разбавлении маточного раствора, т.е. изначально приготовленного экстракта (1:50), 10 мкл экстракта проявлял антиоксидантную активность, равную таковой для 0,487 микромоль аскорбиновой кислоты (экстракты из ЛСД), в то время как такое же количество экстракта из ЛМД проявляло антиоксидантную активность, соответствующую 0,698 микромоль аскорбиновой кислоты, что почти в 1,4 раза превышает антиоксидантную активность экстрактов из ЛСД. При дальнейшем разбавлении маточного раствора (1:100), 10 мкл экстракта из ЛСД проявляли антиоксидантную активность, равную 0,196 микромоль аскорбиновой кислоты, а такое же количество экстракта из ЛМД проявляло антиоксидантную активность, соответствующую 0,224 микромоль аскорбиновой кислоты, что почти в 1,1 раза превышает АОА экстрактов из листьев старых деревьев.

Определение АОА изучаемых экстрактов перманганатометрическим методом.

Для количественной оценки АОА экстрактов перманганатометрическим методом используется показатель активности - В. Эта величина представляет собой сумму биологически активных веществ (БАВ) восстанавливающего характера и выражается количеством миллиграммов кверцетина на 1 мл или 1 г препарата. Чем выше величина В, тем более высокой АОА обладает объект.

В таблице 2 приведены сравнительные данные АОА водных и этаноловых экстрактов листьев абрикоса, полученных перманганатометрическим методом в зависимости от возрастных особенностей деревьев (таблица 2).

Таблица 2 - Антиоксидантная активность экстрактов из абрикосовых листьев (ЛСД и ЛМД) (n=4, P<0,05)

Как показывают результаты исследования, экстракт из ЛМД проявляет большую АОА, чем экстракт из листьев старых деревьев. Между водным и спиртовым экстрактами также обнаружена разница в АОА (LSD=0,56, n=4, P<0,05).

Этот факт хорошо согласуется с данными по содержанию в изученных образцах таких биологически активных соединений, как все фенольные соединения, флавоноиды, витамин С (таблица 3, 4).

Таблица 3 - Содержание фенольных соединений в экстрактах из сухих листьев абрикоса (n=4, P < 0,05) на массу воздушно-сухого сырья

Таблица 4 - Содержание аскорбиновой кислоты в листьях старых и молодых деревьев абрикоса (средние данные выражены в мг/100 г на сырой вес)

Определение АОА изучаемых экстрактов вольтамперометрическим методом.

В этом методе в качестве модельной реакции используется процесс электровосстановления кислорода (ЭВ О2) на ртутно- пленочном электроде, идущий по механизму, аналогичному восстановлению кислорода во многих объектах искусственного и природного происхождения. Предполагается, что антиоксиданты, имеющие восстановительную природу, реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности индикаторного электрода.

В качестве критерия АОА исследуемых экстрактов используется кинетический критерий К, который отражает количество кислорода и активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантом АО (или смесью АО) за минуту.

В таблице 5 и на рисунках 1 и 2 представлены полученные данные по измерению антиокислительной активности экстрактов из листьев абрикоса вольтамперометрическим методом. Антиоксидантная активность экстрактов была сравнена с аналогичными показателями стандартных (эталоновых) антиоксидантов (рутина, танина, витамина С).

Пример вольтамперограммы для эталоновых растворов витамина С, танина и рутина приведен на рисунке 1 (а, б, с), на котором видно уменьшение тока ЭВ О2 и сдвиг потенциала в положительную область относительно максимума тока фонового электролита.

Исходя из экспериментальных данных, приведенных в таблице 5, можно сделать вывод о том, что как водный, так и этаноловый экстракты листьев абрикоса обладают высокой АОА, сравнимой с примененными стандартами - танина, витамина С и рутина. Значение |К| составило для водных экстрактов 0,532 (эталоны: аскорбиновая кислота и танин) и 183 мкмоль/лÅмин при концентрации 10^-2 г/мл для этанолового экстракта (эталон: рутин). При повышении концентрации экстракта в 2 раза наблюдается значительное повышение АОА.

Сдвиг потенциала максимума тока восстановления кислорода в положительную область указывает на достаточно высокое содержание полифенольных соединений в листьях абрикоса.

С целью обобщения полученных результатов был осуществлен соответствующий корреляционный анализ (рисунок 3).

Коэффициенты корреляции, определенные вольтамперметрическим методом, составили для дубильных вещест - 0,15, фенольных соединений (ФС) - 0,71, для флавонолов - 0,89 соответственно.

Таким образом, получены достоверные коэффициенты корреляции между АОА и содержанием ФС в экстрактах. Особое влияние на величину АОА экстрактов оказывают флавонолы.

ВЫВОДЫ.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы: в различных модельных системах экстракт из листьев абрикоса оказывает прямое антиоксидантное действие; этаноловый экстракт обладает более выраженным антиоксидантным действием по сравнению с раствором водного экстракта. Подавление свободно-радикального окисления имеет прямую зависимость от концентрации: чем выше концентрация, тем больше АОА. Основной вклад в АОА листьев абрикоса вносят вещества полифенольной природы; при этом наибольшей активностью обладают флавонолы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ГФ. Государственная фармакопея ХI издание. Выпуски 1,2.-М: Медицина, 1998. - 397 с.
2. Ермаков А.И., Арасимович В.В, Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений // Агропромиздат. - 1987. - 430 с.
3. Зенков Н.К., Панкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. - М.: МАИК Наука Интерпериодика, 2001. - 343 с.
4. Максимова Т.В., Никулина И.Н., Пахомов В.П., Шкарина Е.И., Чумакова З.В., Арзамасцев А.П. Патент России // Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова. - М.: 2000. - №2. - С. 71-84.
5. Ненужное для неучей. "Научное наследство" Амирдовлат Амасиаци. - М.: Наука, 1990. - Т. 13. - 294 с.
6. Пат. 2238554 Российская Федерация, МКИ G01 N33/15 N27/26. Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ / В.П. Пахомов [и др.] (РФ). - № 2003123072/15; заявл. 25.07. 03; опубл. 20.10.04, Бюл. № 15. - 3 с.
7. Штробля А.Л., Фира Л.С., Лихацкий П.Г., Пыда В.П., Вашкеба Э.М., Медвидь И.И. Изучение гепатозащитных свойств сухого экстракта из листьев абрикоса обыкновенного на модели поражения печени тетрахлорметаном // ВЕСТНИК РАМН. -2013. -№ 3 - C. 68-72.
8. Athar M. Oxidative stress and experimental carcinogenesis //Indian J. Exp. Biol. -2002. - Vol.40. - N.6. - P. 656-667.
9. Bandyopadhyay D., Chattopadhyay A., Ghosh G., Datta AG. Oxidative stress-induced ischemic heart disease: protection by antioxidants //Curr. Med. Chem. - 2004. - Vol.11. - N.3.-P.369-387.
10. Bonda D.J, Wang X, Perry G, et al. Oxidative stress in Alzheimer disease: a possibility for prevention //Neuropharmacology.- 2010.- Vol.59. - N.4. -P. 1-5.
11. Droge W., Free radicals in the physiological control of cell function// Physiological Reviews. -2002.-Vol.82.-P.47-95.
12. Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning) // Free Radic. Res. - 1999. - Vol. 31. - № 4. - P. 261-272.
13. Yeung H-C. Handbook of Chinese Herbs and Formulas Institute of Chinese Medicine, Los Angeles //The American Society for Nutritional Sciences J. Nutr. - 2004. - Vol.134. - P. 1105-1109.
14. Young I.S., Woodside J.V. Antioxidants in health and disease//J. Clin. Pathol. - 2001. - V.54. - N.3. - P. 176-186.
15. Willcox J.K, Ash S.L, Catignani G.L. Antioxidants and prevention of chronic disease //Critical Reviews in Food Science and Nutrition.- 2004.- Vol. 44.- P. 275-295.