На базе кафеДры стоматологии Детского возраста было обслеДовано 14 поДростков в возрасте 14-16 лет с Диагнозом хронический фиброзный периоДонтит. Из системы корневых каналов кажДого пациента были взяты мазки Для Дальнейшего посева и иДентификации чистых культур S.mutans и C.albicans. МетоДом Диффузии в агар была изучена чувствительность выДеленных штаммов на материалы Для временной обтурации корневых каналов «Гриназоль» и «ЛеДермикс». Далее статическим метоДом была изучена способность Данных микроорганизмов формировать биопленки. Результаты Данного исслеДования имеют важное практическое значение в клинике Детской энДоДонтии.
Актуальность. Сегодня стоматологический рынок предлагает широкий выбор материалов для временной обтурации корневых каналов. Это в некоторой степени осложняет выбор наиболее подходящего материала в клинической практике врача-стоматолога-терапевта.
В настоящее время большое внимание уделяется проблеме эндодонтического лечения зубов с осложненным кариесом. В структуре стоматологических заболеваний периодонтит занимает третье место после кариеса и пульпита, является одной из наиболее частых причин развития воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области и удаления зубов (Боровский Е.В., 2003; Уразалин Ж.Б., Ибрагимова Р.С., 2005; Копбаева М.Т., Жунусова Л.Ж., 2009).
Основной задачей эндодонтического лечения является полная элиминация системы корневых каналов. Только в случае полной и адекватной дезинфекции полости зуба и корневых каналов исход лечения будет благоприятным. При несвоевременном лечении кариеса возникает осложненный кариес (пульпиты, периодонтиты). [1]
На этапах лечения острых и обострившихся хронических форм периодонтита применяются материалы для временной обтурации корневых каналов в целях более качественной стерилизации и предупреждения осложнений. [2]
Биопленка (биофильм) - конгломерат микроорганизмов, расположенных на какой-либо поверхности, окруженный внеклеточным (экстрацеллюлярным) матриксом. Внеклеточный матрикс - полимерное вещество, выделяемое микроорганизмами в составе биопленки. [3]
Доказано, что биопленки способны образовывать более 90% изученных видов бактерий, а их формирование выявляется более чем при 80% хронических заболеваний микробной этиологии. [4] Характерное свойство всех биопленок - их поразительная устойчивость к физическим и биохимическим воздействиям, включающим антибиотикорезистентность (АБ-резистентность). [5]
Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования явилось изучение микробиологической эффективности материалов для временной обтурации корневых каналов: «Гриназоль» и «Ледермикс», применяемых в клинике детской терапевтической стоматологии.
Для достижения данной цели были решены следующие задачи:
- Сформировать исследуемую группу детей с диагнозом хронический фиброзный периодонтит. Провести соответствующие клинические исследования.
- Подготовить все необходимые материалы и выбрать основной метод для проведения клиникомикробиологического исследования.
- Обоснование мультирезистентности внутриканальной микрофлоры методом изучения возможности исследуемых штаммов S.mutans и C.albicans образовывать биопленки (биофильмы).
- Провести все необходимые клинико-микробиологические исследования и адекватно интерпретировать результаты.
Материалы и методы исследования. Нами на базе Института стоматологии КазНМУ имени С.Д.Асфендиярова было обследовано 14 подростков в возрасте 14-16 лет с диагнозом хронический фиброзный периодонтит.
Исследуемый материал (содержимое корневых каналов) мы получали из каждого корневого канала пациента с хроническим фиброзным периодонтитом с помощью стерилизованных в сухожаровом шкафу абсорбентов (бумажных штифтов) и далее погружали их в пробирки с физиологическими растворами. Пробирки с исследуемым материалом мы доставляли на кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии на посев для последующей идентификации S.mutans и C.albicans. Далее производили посев содержимого корневых каналов из физиологического раствора на кровяной агар и среду Сабуро, чашки Петри помещали в термостат (24 часа, 37≧С).
Паста «Гриназоль» - паста для дентального использования. Основное активное вещество - метронидазол, который является противомикробным веществом, производным имидазола, оказывающим действие на анаэробные инфекции.
Паста «Ледермикс» - лекарственное средство для лечения и профилактики пульпитов и периодонтитов. Представляет собой высокоэффективную комбинацию антибиотика (демеклоциклина гидрохлорид) и глюкокортикостероида (триамцинолона ацетонид).
Из корневых каналов всех 14 пациентов нам удалось впоследствии выделить S.mutans и C.albicans.
Идентификацию S.mutans проводили по биохимическим свойствам [6], которые дают положительную реакцию с маннитом и сорбитом, а с сахарозой и перекисью водорода отрицательную. Важно отметить, что по классификации Брауна (1919) S.mutans является a-гемолитическим (зеленящим) стрептококком [7], это его основное культуральное свойство.
На среде Сабуро выросло множество колоний грибов. Колонии C.albicans выглядели как беловато-кремовые, выпуклые и округлые сливочки. Мы провели микроскопию колоний (C.albicans образуют псевдомицелий и хламидоспоры), схожих по культуральным признакам с C.albicans и таким образом смогли их идентифицировать Определение активности образцов материалов для временной обтурации корневых каналов проводили методом диффузии в агар с использованием лунок (диаметр 6мм). Результаты оценивали по величине (диаметру) задержки зон роста вокруг образцов мазей. Чувствительность культур к пастам подтверждали по наличию или отсутствию зоны задержки роста вокруг сформированной лунки.
В первую очередь мы производили посев штаммов C.albicans на среду Сабуро и S.mutans на кровяной агар в чашки, которые мы предварительно разделили на 2 сектора: сектор 1 - паста «Гриназоль», сектор 2 - паста «Ледермикс». В каждом секторе создавали лунки (углубления на поверхности агара) и помещали в них исследуемый материал для временной обтурации корневых каналов. Затем отправляли чашки в термостат (24 часа, 37≧С).
Способность исследуемых штаммов формировать биопленки было определено по статической методике, которая была аналогична как в случае со S.mutans, так и с C.albicans [6]. Преимуществом данного метода является возможность увидеть способность микроорганизмов образовывать биопленки на гидрофобной поверхности пластика и на гидрофильной поверхности стекла.
Этапы выявления формирования биопленок статическим методом:
- Стерилизуем покровные стекла (помещаем в емкости с этиловым спиртом). Вносим их в стерильные пластиковые чашки Петри по одному стерильным пинцетом. Подсушиваем закрытые чашки со стеклами в термостате.
- Ночные культуры тестируемых штаммов в разведении 1:100 (в свежей питательной среде: S.mutans на сахарном бульоне, C.albicans на жидком Сабуро) вносим стерильно по 4 мл в чашки со стеклами таким образом, чтобы клеточная суспензия равномерно покрывала дно чашки. В качестве контроля фона в одну из чашек с покровным стеклом вносим стерильную питательную среду. Чашки помещаем в термостат (28:, 24 часа).
- На следующий день содержимое чашек нужно аккуратно удалить, чтобы не повредить сформировавшиеся биопленки. Затем вносим в чашки по 4 мл дистиллированной воды и по 400 мкл 1% спиртового раствора кристалл виолета и оставляем при комнатной температуре на 45 минут.
- Затем окрашенный раствор осторожно отсасываем и 3 раза промываем чашки со стеклами дистиллированной водой, стараясь не повредить окрашенные биопленки, которые образовались на стекле и на дне чашек.
- Подсушиваем чашки со стеклами. В результате получаем визуально определяемую биопленку, если этот микроорганизм способен формировать биопленки.
Результаты и их обсуждение.
Хронический фиброзный периодонтит у исследуемых подростков развился вследствие осложнения кариеса. Окончательный диагноз ставился на основе данных клинических и рентгенологических исследований [8].
Таким образом, проведенные нами клиникомикробиологические исследования in vitro показали, что:
- штаммы C.albicans 100% нечувствительны к действию материалов для временной обтурации корневых каналов «Гриназоль» и «Ледермикс» (рис.1);
- штаммы S.mutans также 100% нечувствительны к действию данных материалов (паст) (рис.2).
В результате клинико-лабораторных исследований силлеров, применяемых для временной обтурации корневых каналов у детей, S.mutans и C.albicans оказались полирезистетными штаммами. Биологические свойства изученных микроорганизмов показали высокую устойчивость к временным эндо- материалам.
Это навело нас на предположение, что данные штаммы микроорганизмов образуют биопленку, которая защищает их от внешних негативных факторов. Большинство микроорганизмов in vivo образуют биопленки, которые представляют собой защитный внеклеточный матрикс, образованный ассоциацией микроорганизмов в его составе [9]. В большинстве случаев разрушить его удается, только комбинируя механические и химические методы воздействия.
Биопленки рассматриваются как фактор более жесткой селекции, увеличивающей способность микроба к адаптации на воздействие внешних факторов. Выделенные штаммы оказались адаптированными, т.е. обладали высокой вирулентной способностью.
Результаты, полученные статическим методом, были таковы, что C.albicans и S.mutans в 100% случаев образуют биопленки. Биопленка визуально определяется в случае с
S.mutans как мелкие окрашенные пятна (рис.3), а в случае с C.albicans как участки более интенсивного окрашивания неправильной формы (рис.4).
Заключение.
Способность микроорганизмов образовывать биопленки, говорит об их высокой вирулентной способности. Несмотря на название биопленка не является однородной субстанцией, она гетерогенна в пространстве и во времени, сквозь биопленку проходят водные каналы, несущие питательные вещества и вымывающие продукты жизнедеятельности микроорганизмов [10].
На этапах эндодонтического лечения необходимо комбинировать инструментальные и медикаментозные методы обработки корневых каналов, что обеспечит механическое разрушение образованных множеством ассоциаций микроорганизмов биопленок в макроканале, а также достаточную дезинфекцию и стерилизацию в макро- и микроканалах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Е. В. Боровский Терапевтическая стоматология. Учебник для студентов медицинских ВУЗов. - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 385 с.
- Календарева Г.А.. Клинико-лабораторное обоснование применения силера для временной обтурации системы корневых каналов при лечении хронического периодонтита : автореф. дисс ... канд. мед. наук - Алматы, 2010. - 89 с.
- G.C.L.Wong, G.A. O'Toole, All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. - 2011. - 36. - Р. 339-342.
- Гостев В.В., Сидоренко С.В. Бактериальные биопленки и инфекции. //Журнал инфектологии. - 2010. - 2(3). - С. 4-15.
- Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. //Lancet. - 2001. - 358. - Р. 135-138.
- Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella Typhimurium. //Журн. Микробиол. - 2006. - №4. - С.3842
- В.В. Меньшикова Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.
- Е. В. Боровский Терапевтическая стоматология // Учебник для студентов медицинских ВУЗов. - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 385 с.
- Mah T-FC, OToole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. - 2001. -9. - Р. 34-39.
- Solomonov M. Биопленка как эндодонтическая инфекция. Practical_scientific journal Clinisheskaya Endodotiya (Clinical Endodontics) (Russia). - 2008. - № 3-4. - Р. 31-34.