Роль генетических тромбофилических маркеров в патогенезе ишемического инсульта

Тромбофилия - наследственное или приобретенное нарушение гемостаза, характеризующееся повышенной наклонностью к развитию тромбозов кровеносных сосудов разного калибра и локализации. В связи с этим весьма актуальным является изучение состояния молекулярно-генетических основ развития ишемического инсульта. Существует перспективная группа генов- кандидатов, которые потенциально могут быть связаны с формированием риска ишемического нарушения мозгового кровообращения - гены системы гемостаза, исследование которых в различных популяциях мира является весьма актуальной задачей ангионеврологии.

Эффективность реперфузионной терапии зависит не только от метода реканализации, но в большей степени от состояния коагулянтной и антикоагулянтной систем организма. В современной литературе гиперкоагуляцонное состояние крови рассматривается как тромбофилия, представляющее собой наследственное или приобретенное нарушение гемостаза, которое характеризуется повышенной наклонностью к развитию тромбозов кровеносных сосудов разного калибра и локализации [1,3,7]. В связи с этим весьма актуальным является изучение состояния молекулярно-генетических основ развития ишемического инсульта. Существует перспективная группа генов-кандидатов, которые потенциально могут быть связаны с формированием риска ишемического нарушения мозгового кровообращения - гены системы гемостаза, исследование которых в различных популяциях мира является весьма актуальной задачей ангионеврологии [2,4,5,6].

Нами проводится работа по изучению роли полиморфизма C677T гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR, компонента участвующего в патогенезе эндотелиальной дисфункции) и полиморфизм 675 4G/5G гена ингибитора активаторов плазминогена-1 (PAI-1 или SERPINE-1, кодирующего компонента плазменного звена гемостаза) в патогенезе ишемического инсульта. Выбор данных полиморфизмов обусловлены тем, что их генотипические варианты могут оказать непосредственное влияние на развитие гиперкоагуляционного синдрома.

Несмотря на интенсивность исследований, данные о роли аллельных полиморфизмов МТГФР (C677T) и PAI-I (4G/5G) в формировании индивидуальной предрасположенности к различным тромботическим осложнениям, данные среди больных ИИ остаются весьма противоречивыми. Кроме того, анализ “ген-генных взаимодействий” остается наименее изученным звеном, способным связать генетические факторы с формированием тромботических осложнений при различных сосудистых патологиях.

Цель работы. Определить прогностическую значимость носительства генотипических вариантов МТГФР (C677T) и PAI-I (4G/5G) и их сочетание в развитии ИИ.

Материалы и методы. Материалами для наших исследований явились образцы ДНК 51 больного с ИИ (16- больных, с хорошим регрессом неврологического дефицита и 35-больных, с завершенным ишемическим инсультом со стойким неврологическим дефицитом). Диагноз ИИ верифицировали согласно клинико-инструментальным (компьютерная томография головного мозга, цветное дуплексное сканирование экстракраниальных артерий) данным. Контрольную группу составили 51 (для МТГФРC677T) и 68 (PAI-I4G/5G) условно-здоровые доноры узбекской национальности, не имевшие в анамнезе тромботических эпизодов, соответствующих по полу и возрасту исследуемому контингенту больных.

Анализ образцов ДНК по генам МТГФР (C677T) и PAI-I (4G/5G) проводили путем стандартной полимеразной цепной реакции и методом ПЦР в режиме реального времени на приборах 2720 «Applied Biosystems» (США) и Rotor-Gene 6000 («Corbett Reseach», Австралия), соответственно. Для генотипирования полиморфизмов использовали тест-системы ООО «АмплиКит» (г. Санкт- Петербург).

Отношение шансов (OR) и доверительные интервалы (CI) для отношения шансов (95%CI) проведены с использованием пакета статистических программ «OpenEpi 2009, Version 2.3». Соответствие распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди–Вайнберга проводилось с помощью компьютерной программы “GenePop” (“Genetics of Population”).

Результаты.

В обследованной объединенной группе больных распределение аллелей C и T генетического маркера МТГФР (C677T) соответствовало 76.5% и 23.5%. Частота этих аллелей в изученной популяционной выборке составила 81.6% и 18.4%, соответственно. При этом несмотря на OR=1.4 различие по частоте встречаемости мутантных аллелей в исследованных группах не достигло критического уровня статистической значимости (χ²=0.8; Р=0.3; OR=1.4; 95%CI 0.7054- 2.632).

Частота распределения генотипов С/С, С/Т, Т/Т полиморфизма МТГФР (C677T) в изученных основной и контрольной группах составили: 56.9%, 39.2%, 3.9% и 65.0%, 33.3%, 1.7%, соответственно. Полученные эти данные оказались достаточно неожиданными, т.к. распределение функционально неблагоприятных генотипов, данного полиморфизма достоверно не отличалось в этих изучаемых выборках (p>0.05). При этом, отмечалось некоторое повышение частоты гомозиготного Т/Т генотипа в группе больных по сравнению с контрольной группой (3.9% против 7%). При этом значение OR также было достаточно высоким (OR=2.2). Однако, выявленное различие между исследованными группами не достигало пределов статистической значимости (χ²=0.5; Р=0.5; 95%CI 0.201125.98). Полученное статистическое незначимое различие вряд ли может свидетельствовать о протективной роли Т/Т варианта полиморфизма МТГФР (C677T), ввиду его положительной ассоциации с высоким уровнем гомоцистеина в крови. Возможно, это связано с низкой частотой данного варианта мутации и с не очень многочисленностью выборки исследованных нами групп.

Необходимо подчеркнуть что, при сравнении частот генотипов и аллелей между подгруппами больных с хорошим регрессом неврологического дефицита и с завершенным ишемическим инсультом со стойким неврологическим дефицитом также были выявлены статистически незначимые различия (p>0.05).

Сравнительный анализ частот аллелей полиморфизма PAI-I (4G/5G) между основной и контрольной группами показал достоверное увеличение носительства неблагоприятного аллеля 4G на 2 раза в группе больных по сравнению с контролем (χ²=6.9; Р=0.008; OR=2.0; 95%CI 1.18-3.321). Выявленное нами повышение частоты 4G в основной группе позволяет говорить о возможной “неустойчивости” лиц с этой аллелю к развитию ИИ.

Распространенность генотипических вариантов 5G/5G, 4G/5G, 4G/4G данного полиморфизма в основной и контрольной группах составили: 38.5%, 21.1%, 40.4% и 36.8%, 54.4%, 8.8%, соответственно. В этой группе больных частота данного генотипа в 7 раз достоверно превышала таковую в контрольной (40.4% против 8.8%, соответственно; χ²=16.8; Р=0.00004; OR=7; 95%CI 2.56419.11). Полученные данные позволяют рассматривать полиморфного варианта 4G/4G гена PAI-I как функционально ослабленного генотипа и как одного из ключевых факторов риска тромботических осложнений в патогенезе ИИ.

Наиболее отчетливая ассоциация была зафиксирована в частоте встречаемости гомозигот 4G/4G в категории больных с завершенным ишемическим инсультом со стойким неврологическим дефицитом по сравнению с больными с хорошим регрессом неврологического дефицита. Носительство данного неблагоприятного генотипа ассоциировано с 5-кратным увеличением риска развития тромботических осложнений в этой подгруппе больных по сравнению со второй подгруппой больных (Х²= 4.3; Р=0.04; OR =5.1; 95%CI 1.34-15.11).

Распределение частот генотипов во всех исследованных выборках соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, за исключением подгруппы больных с завершенным ишемическим инсультом со стойким неврологическим дефицитом, в которой были обнаружены отклонения от данного распределения для полиморфного маркера PAI-I (χ²=17.3; р< 0.05). По всей видимости, это связано с недостатком фактических гетерозигот по данному полиморфизму. Уровень наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности среди больных варьировал от 0,16 до 46 соответственно, что подтверждается высокими положительными значениями индекса фиксации Райта (D=+0.58).

Следующим этапом работы явилось изучение ассоциативных связей между различными генотипическими комбинациями маркеров МТГФР (C677T) и PAI-I (4G/5G) и оценка неслучайных генотипических сочетаний в исследуемых группах. Одновременное наличие мутаций в генах МТГФР (C677T) и PAI-I (4G/5G) в гомозиготном состоянии было выявлено у 1/51 (2.0%) пациентов и не обнаруживалось среди популяционной группы. Частота “двойных гетерозигот” в обследованных группах составила 1/57 (1.7%). В изученной группе больных (особенно среди больных с завершенным ишемическим инсультом со стойким неврологическим дефицитом) доля “гетеро/гомозигот” (C/T+4G/4G) составила 17.6%, тогда как в контроле эта цифра была почти в 3.8 раза достоверно ниже – 5.3% (χ²=4.2; Р=0.04; OR=3.8; 95%CI 1.0-15.14). Эти предварительные данные также показывают высокую значимость влияния “ген-генных взаимодействий” тромбофилических маркеров МТГФР (C677T) и PAI-I (4G/5G) в развитии ИИ.

Таким образом, полученные нами результаты раскрывают некоторые генетические механизмы формирования тромботических осложнений у больных с ИИ и свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения других ключевых генов-кандидатов, вовлеченных в патогенезе тромбофилии. Изучение вклада генетических факторов в развитие ИИ, окажет неоценимую помощь в разработке комплексной программы по персонализированной профилактике данной патологии с учетом генетических характеристик, что позволит избежать развития возможных тяжелых тромботических осложнений.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Генетика ишемического инсульта / В.И.Скворцова, С.А. Лимборская, П.А. Сломинский и др. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2001. - №4. – С. 17-21.
2. Визир В.А., Березин А.Е. Генетическая детерминация как независимый фактор риска возникновения мозгового инсульта // Украïнський медичній часопис. - 2002. - № 3. - С. 25-36.
3. Гусев Е.И., Фаворова О.О., Судомоина М.А. Полиморфизм генов фибриногена у больных с ишемическим инсультом // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2008. - №4. - С. 27-30.
4. Иллариошкин С.Н. Генетика сосудистых заболеваний мозга. Очерки ангионеврологии. /Под ред. Суслиной З.А. - М.: Атмосфера, 2005. - 341 с.
5. Тупицына Т.В. Молекулярно-генетический анализ факторов риска коронаросклероза и ишемической болезни мозга: автореф. дис. … канд. биол. наук / Тупицына Татьяна Викторовна. - М.: 2007. - 31 c.
6. Genetic Association Studies in Ischaemic Stroke / D. Matarin, O. Pruissen, L.J. Kappelle etal. // Cerebrovascular Disease. - 2009. - Vol. 27. - Р. 290-294.
7. The genetics of ischaemic stroke / M. Matarin1, A. Singleton, J. Hardy, J. Meschia // Journal of Internal Medicine. - 2010. - 267. - Р.139155.