Влияние острого нарушения кровообращения в бассейне сонных артерий на содержание белка р53+ в нервных и глиальных клетках коры теменной доли больших полушарий головного мозга лабораторных крыс

Изучено в динамике влияние острого нарушения мозгового кровообращения в бассейне сонных артерий на активность проапоптотических процессов в нервных и глиальных клетках коры теменной доли полушарий головного мозга. В коре теменной доли полушарий головного мозга двусторонняя 20-минутная каротидная ишемия с последующей реперфузией снижает плотность расположения р53+-глиоцитов на 12-е сутки наблюдения, повышает процент р53+-нейронов и снижает процент р53+-глиоцитов как после одночасовой реперфузии, так и на 12-е сутки.

Каротидная ишемия-реперфузия в нейроцитах коры теменной доли увеличивает концентрацию белка р53+ в раннем ишемически- реперфузионном периоде и снижает ее в нейро- и глиоцитах – в позднем; нарушает морфометрические параметры р53+-нейроцитов в оба срока наблюдения, а глиоцитов – в позднем.

Введение. Глобальное распространение цереброваскулярных заболеваний, частое возникновение их в молодом возрасте, высокий процент инвалидизации и смертности определяют медико-социальную значимость изучения этой патологии [1].

На сегодняшний день имеется значительный объем информации касательно практически всех звеньев патологического процесса, которые запускаются при ишемическом повреждении головного мозга [2, 3], начиная от развития энергетического стресса [4], формирования явлений эксайтотоксичности [5] и заканчивая гибелью клеток путем некроза или апоптоза. В последние годы особую актуальность приобретают исследования, посвященные раскрытию молекулярно-генетических основ гибели нервных и глиальных клеток [6]. Выяснение того, какой вид клеточной смерти преобладает при развитии постреперфузионных поражений центральной нервной системы, во-первых, имеет важное практическое значение для разработки новых методов патогенетической терапии инсульта, поскольку регенераторный потенциал нейронов резко ограничен и потеря даже части клеток может закончиться фатально [7, 8]; во-вторых, эта информация позволит прогнозировать индивидуальную чувствительность различных отделов мозга при цереброваскулярных катастрофах.

В настоящее время изучено влияние ишемии-реперфузии на фрагментацию ДНК клеток соматосенсорной коры головного мозга крыс [9], однако степень реагирования на это вмешательство отдельных клеток (нейронов, глии) теменной доли, а также процессы апоптоза остаются неисследованными.

Цель работы. Исследовать влияние двусторонней 20минутной каротидной ишемии с реперфузией различной продолжительности на содержание белка р53+ в различных клетках коры теменной доли полушарий лабораторных крыс.

Материалы и методы. Исследования выполнены на крысах-самцах трех групп: 1. Контрольные животные; 2. Крысы, которым моделировали 20-минутную двустороннюю каротидную ишемию с одночасовой реперфузией (ранний ишемически-реперфузионный период); 3. Крысы, которых выводили из эксперимента на 12-е сутки после моделирования 20-минутной ишемии (поздний ишемически-реперфузионный период).

Моделирование каротидной ишемии-реперфузии осуществляли под калипсоловым наркозом (75 мг/кг массы тела) путем 20-минутного пережатия обеих общих сонных артерий [10], после чего кровоток по этим сосудам восстанавливали. Животных выводили из эксперимента декапитацией под калипсоловым наркозом. Пользуясь атласом стереотаксических координат [11] на холоде забирали кору теменной доли (КТД) полушарий головного мозга, в течение 24 ч фиксировали в растворе Буэна и заливали в парафин, готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм. Затем осуществляли депарафинизацию в ксилоле, регидрацию в нисходящих концентрациях этанола и отмывание в 0,1 М фосфатном буфере. После обработки с моноклональными антителами срезы изучали в флуоресцентном микроскопе AXIOSKOP (Zeiss, Германия) методом иммунофлуоресценции. Исследовали плотность расположения и морфометрические параметры р53+ клеток с помощью компьютерной системы цифрового анализа VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Германия). Статистическую значимость различий оценивали по t-критерию Стьюдента для независимых выборок. Данные представлены в виде средних арифметических и стандартного отклонения.

Результаты исследования и их обсуждение. Результаты изучения плотности расположения и процентного соотношения р53+ нервных и глиальных клеток КТД полушарий головного мозга представлены в табл. 1. Обращает внимание тот факт, что в исследуемом отделе неокортекса интактных животных количество р53+- глиоцитов в 3,7 раза выше, чем р53+-нейроцитов, что, вероятно, обусловлено более интенсивным уровнем в них апоптотических процессов.

Установлено, что 20-минутная каротидная ишемия с одночасовой реперфузией не привела к достоверным изменениям плотности расположения р53-положительных нервных и глиальных клеток КТД. Однако на 12-е сутки постишемического периода в исследуемой части коры наблюдалось достоверное снижение плотности расположения р53+-глиоцитов в 4,7 раза по сравнению с таковой у контрольных крыс и в 4,3 раза - относительно показателя в раннем постишемическом периоде.

Анализ процентного соотношения различных классов р53клеток КТД показал, что в раннем постишемическом периоде произошло достоверное увеличение на 29 % количества р53+-нейроцитов и уменьшение на 10 % количества глиоцитов относительно соответствующих показателей в контрольной группе крыс. На 12-е сутки ишемически-реперфузионного периода процент р53нейронов возрос в 3,3 раза относительно показателя в контроле и в 2,5 раза - по сравнению с показателем в раннем сроке наблюдения, а процент глиальных клеток, наоборот, уменьшился в 4,1 и 3,7 раза соответственно.

По результатам оценки раннего воздействия ишемии- реперфузии головного мозга на концентрацию белка р53установлено (табл. 2), что данный показатель в нейроцитах повысился на 19 % по отношению к показателю у контрольных животных, а в глиоцитах изменений не зафиксировано. В условиях позднего постишемического периода исследуемый параметр в нервных клетках уменьшился в 2 раза по отношению к контролю и в 2,4 раза - по сравнению с ранним сроком исследования, а в глиальных клетках - на 16 и 18 % соответственно.

В условиях раннего ишемически-реперфузионного повреждения КТД полушарий головного мозга в нейроцитах наблюдалось достоверное возрастание общего содержаниябелка р53+ на 4 % относительно контроля, а на 12-е сутки ишемически-реперфузионного периода этот показатель повысился на 13 % по отношению к таковому у контрольной группы крыс и на 9 % - по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. В оба периода ишемически-реперфузионного повреждения КТД не обнаружено достоверных изменений содержания белка р53+ в глиальных клетках.

20-минутная ишемия с одночасовой реперфузией вызвала в исследуемой части неокортекса снижение дисперсии распределения белка р53+ в нервных и глиальных клетках на 25 и 23 % соответственно относительно показателя контрольной группы животных. Однако на 12-е сутки ишемически-реперфузионного периода данный параметр в нейроцитах и глиоцитах возрос на 92 и 78 % соответственно относительно контрольной группы животных и на 157 и 130% соответственно - по сравнению с ранним сроком наблюдения.

Анализ изменений морфометрических параметров клеток КТД в раннем постишемическом периоде показал, что площадь р53+-нейро- и глиоцитов изменений не претерпела. Однако в позднем постишемическом периоде отмечалось достоверное увеличение площади р53+-глиоцитов на 29 % по отношению к показателю у контрольных крыс и на 26 % - относительно раннего срока наблюдения, а исследуемый показатель нервных клеток возрос в оба периода на 310 %. Каротидная ишемия с одночасовой реперфузией привела к росту коэффициентов формы и элонгации р53+-нервных клеток на 7 и 5 % соответственно относительно контроля, а данные показатели р53+-глиальных клеток изменений не претерпели.

В позднем периоде ишемически-реперфузионного повреждения КТД обнаружено, что коэффициенты формы и элонгации р53+ нервных клеток достоверно уменьшились на 18 и 6 % соответственно по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Однако по отношению к контрольной группе животных имело место снижение только коэффициента формы на 12 %. В свою очередь, коэффициенты формы и элонгации р53+-глиальных клеток снизились на 3 % и 4 % соответственно относительно как контроля, так раннего срока наблюдения.

Выводы: 1. В коре теменной доли полушарий головного мозга двусторонняя 20-минутная каротидная ишемия с последующей реперфузией снижает плотность расположения р53+-глиоцитов на 12-е сутки наблюдения, повышает процент р53+-нейронов и снижает процент р53+- глиоцитов как после одночасовой реперфузии, так и на 12-е сутки.

Каротидная ишемия-реперфузия в нейроцитах коры теменной доли увеличивает концентрацию белка р53+ в раннем ишемически-реперфузионном периоде и снижает ее в нейро- и глиоцитах - в позднем; нарушает морфометрические параметры р53+-нейроцитов в оба срока наблюдения, а глиоцитов - в позднем.

Таблица 1 - Количество р53+-нейроцитов и глиоцитов в коре теменной доли полушарий крыс с ишемически-реперфузионным повреждением головного мозга (на 1 мм2) (М±m)

Группа наблюдения

Количество р53+- нейроцитов на 1 мм2

Количество р53+- глиоцитов на 1 мм2

Контроль (n=11)

21,00±1,20

78,64±4,92

24,88±1,80

75,12±1,81

Ишемия-реперфузия 20 мин / 1 час

25,69±2,67

72,64±7,26

(n=11)

32,16±2,10*

67,83±2,10*

Ишемия-реперфузия

19,69±1,93

16,72±3,16*^

(12 суток) (n=11)

81,75±3,16*^

18,25±3,16*^

Примечание: в числителе - суммарная плотность различных классов клеток на 1 мм2 коры теменной доли полушарий головного мозга; в знаменателе - процент различных классов клеток; вероятность разницы по сравнению с * - контролем; ^ - ишемией- реперфузией (20 мин / 1 час)

Таблица 2 - Содержание белка р53 и морфометрические параметры р53+ нервных и глиальных клеток коры теменной доли полушарий крыс с ишемически-реперфузионным повреждением головного мозга (М ± m)

Группа наблюдения

Концентраци я р53 ИРМ Еиф

Содержание р53 ИРМ Еиф

Дисперсия распределения р53ИРМ

Площадь, мкм2

Коэфициент формы

Коэфициент элонгации

Нервные клетки

Контроль

0,452±0,006

2,269±0,019

31,26±1,09

77,88±3,65

0,648±0,013

0,620±0,011

(n=11)

           

Ишемия- реперфузия

0,539±0,007

2,349±0,018

23,41±0,68

76,99±3,30

0,694±0,012

0,652±0,011

р1<0,001

р1<0,01

р1<0,001

р1<0,01

р1<0,05

20 мин / 1 час (n=11)

 

Ишемия-

0,228±0,014

2,554±0,035

60,09±1,17

241,45±18,55

0,574±0,018

0,618±0,014

реперфузия

р1<0,001

р1<0,001

р1<0,001

р1<0,001

р1<0,001

 

(12 суток)

р2<0,001

р2<0,001

р2<0,001

р2<0,001

р2<0,001

р2<0,05

(n=11)

           

Глиальные клетки

 

0,395±0,003

1,275±0,011

31,91±0,59

9,36±0,24

0,814±0,005

0,675±0,005

Контроль

           

(n=11)

           

Ишемия-

0,403±0,003

1,290±0,012

24,69±0,39

9,55±0,25

0,821±0,005

0,674±0,005

реперфузия

20 мин / 1 час (n=11)

   

р1<0,001

     

Ишемия-

0,332±0,003

1,315±0,027

56,67±1,23

12,07±0,73

0,793±0,012

0,653±0,010

реперфузия

р1<0,001

 

р1<0,001

р1<0,001

р1<0,05

р1<0,05

(12 суток)

(n=11)

р2<0,001

 

р2<0,001

р2<0,01

р2<0,05

р2<0,05

Примечание. - вероятность разницы по сравнению с: р1 - контролем (р<0,05, р<0,01, р<0,001); р2 - ишемией-реперфузией (20 мин / 1 час) у контрольных животных (р<0,05, р<0,01, р<0,001)

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Woodruff T. M., Thundyil J., Tang S.-C. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.// Molecular Neurodegeneration. – 2011. – V. 6, № 11. – P. 1750-1766.
  2. Шляхто Е.В., Баранцевич Е.Р., Щербак Н.С., Галагудза М.М. Молекулярные механизмы формирования ишемической толерантности головного мозка. Часть 2 // Вестник РАМН. – 2012. – № 7. – С. 20-29.
  3. Chavez J.C., Hurko O., Barone F.C., Feuerstein G.Z. Pharmacologic interventions for stroke: looking beyond the thrombolysis cologic interventions for stroke: looking beyond the thrombolysis // Stroke. – 2009. – V. 40, № 10. – P. 558-563.
  4. Nakka V.P., Gusain A., Raghubir R. Endoplasmic reticulum stress plays critical role in brain damage after cerebral ischemia/reperfusion in rats // Neurotox. Res. - 2010. - V. 17, № 2. - P. 189-202.
  5. Dongxu Zhai, Kyle Chin, Min Wang, Fang Liu. Disruption of the nuclear p53-GAPDH complex protects against ischemia-induced neuronal damage // Molecular Brain. - 2014. - V. 7, № 20. - P.1-12.
  6. Шетова И. М. Роль полиморфных вариантов генов-регуляторов апоптоза: поли(адф-рибозы) полимеразы-1, апоптозиндуцирующего фактора и р53 в патогенезе ишемического инсульта : дис. … канд. мед. наук : 14.00.13. - Москва, 2005. - 146 с.
  7. Knight R., Melino G. Cell death in disease: from 2010 onwards // Cell Death Dis. - 2011. - V. 2, № 9 - Р. 1-6.
  8. Favaloro B., Allocati N., Graziano V. Role of Apoptosis in disease // Aging. - 2012. - V. 4, № 5. - Р. 330-349.
  9. Семененко А.І., Ходакiвський О.А., Черешнюк І.Л. [та iн.] Вплив iнфузiйних розчинiв на фрагментацiю ДНК клiтин соматосенсорноï кори при iшемiï-реперфузiï головного мозку у щурiв / / Експериментальна та клiнiчна фiзiологiя i бiохiмiя. - 2014. - № 3. - С. 14-18.
  10. Скибо Г. Г. Использование различных экспериментальных моделей для изучения клеточных механизмов ишемического поражения мозга // Патология. - 2004. - Т. 1, № 1. - С. 22-30.
  11. Kоnig J. F., Klippel P. A. The rat brain. A stereotaxis atlas of forebrain and lower part of the brain stem.- Baltimora: The Williams and Wilkins Company, 1963.-162 p.
Год: 2015
Город: Алматы
Категория: Медицина
loading...