Получение бесклеточного матрикса пищевода овец для тканевой инженерии

В работе описывается влияние различных протоколов децеллюляризации на гистологию и биосовместимость ткани пищевода с учетом дальнейшего использования в тканевой инженерии. Пищевод мелкого рогатого скота обрабатывали перфузионным методом для создания биосовместимого биологического каркаса, который имитируют нативную архитектуру пищевода. Оптимальная децеллюляризация пищевода была достигнута после обработки Triton X100 с последующей обработкой ЭДТА. Гистологический анализ показал сохранность внеклеточной матричной структуры ткани с отсутствием клеточных элементов и незначительным содержанием ДНК.

Введение.

В мире каждый год регистрируется более 500 тыс. человек с диагнозом рак пищевода и по прогнозам к 2030 году эта цифра увеличится до 850 тыс. Около 30% из них, а также пациентам с травматическими и врожденными нарушениями пищевода, в конечном счете, придется пройти хирургическую резекцию пищевода [1]. В свою очередь, рак пищевода составляет, по оценкам, 400000 смертей в год и занимает шестое место по смертности от онкологических заболеваний.

Республика Казахстан не является исключением, и проблема заболеваемости раком пищевода остается одной из наиболее актуальных. Ежегодно выявляется свыше 1500 новых пациентов с данной патологией, при этом, смертность от данного заболевания занимает третье место среди всех злокачественных новообразований [2]. Как было указано на съезде онкологов Казахстана в 2014 г. местное население заболевает раком пищевода в 10-11 раз чаще, чем лица европейской национальности. При этом удельный вес коренного населения с раком пищевода составила 78% [3].

Существует разнообразные хирургические операции для восстановления пищеварительной преемственности, в том числе замена, с использованием тканей, взятых из желудка, толстой кишки или тощей кишки. Тем не менее, эти восстановительные процедуры сложны и связаны с существенной послеоперационной заболеваемостью и смертностью [4-7].

В последнее время, внимание ученых привлекли подложки из внеклеточной матрицы (ВКМ) живых организмов. Известно, что данный материал является оптимальным для роста на его поверхности различных клеток. Получение такого материала возможно методом децеллюляризации (удаление клеток), которая позволяет получить биологический каркас органов и тканей с сохранением ВКМ и трехмерной структуры органов [8-10].

Целью данного исследования была разработка протокола децеллюляризации пищевода мелкого рогатого скота для применения в качестве основы для тканевой инженерии. При этом основой процесса было удаление всех клеток из пищевода, но одновременно сохраняя структуру и функцию ВКМ пищевода.

Материалы и методы.

Создание бесклеточной матрицы пищевода.

В исследованиях был использован пищевод овец, 1,5-2,0 летнего возраста из местной скотобойни. Пищевод длиной 50-60 мм был очищен и промыт стерильным фосфатным буфером, содержащей 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 0,25 мг/мл амфотерицина Б. Децеллюляризацию проводили перфузионным методом, описанным ранее [1]. При этом оба конца пищевода закрепляли к катетеру c внутренним диаметром 1,0 см. Катетеры присоединяли с помощью силиконовых трубок к перистальтическому насосу (5106 Heidolph) и пропускали растворы для децеллюляризации со скоростью 9 мл/мин. Растворы для децеллюляризации содержали Triton X100(Fluka), додецилсульфат натрия (SDS, Sigma), этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА, Helicon) и трипсин (Sigma), которые ранее применялись для децеллюляризации пищевода крыс [11, 12]. Ткань пищевода была разделена на 5 групп:

1. группу обрабатывали 0,6% Triton X100 в течение 24 ч с последующей обработкой 5 мМ ЭДТА в течение 12 ч.
2. группа: 0,6% Triton X100 – 24 ч и затем 12 ч 0,5% трипсин.
3. группа: 0,6% SDS 24 ч и затем 24 ч 5 мМ ЭДТА.
4. группа: 0,6% SDS 24 ч и затем 12 ч 0,5% трипсин.

Контрольная группа: ткань нативного пищевода без обработки, которую использовали для сравнительного изучения гистологии и ДНК-содержания. Содержание ДНК в пробах определяли с помощью набора ДНК-сорб-В (Россия) согласно инструкции производителя. Все этапы проводили при комнатной температуре.

Гистология децеллюляризированного пищевода.

Образцы децеллюляризированного пищевода фиксировали в 4% формалине с последующей заливкой в парафин. В качестве контроля использовали ткань необработанного пищевода. Готовили срезы толщиной 5 мкм для гистологического окрашивания на микротоме (NS2). Срезы обрабатывали ксилолом в течение 10 мин с последующей дегидратацией через серию повышающих концентраций спиртов. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Определение содержания ДНК.

Для определения наличия ДНК в обработанной ткани пищевода срезы, приготовленные, как описано выше окрашивали DAPI (4',6-diamidino-2-Phenylindole, Sigma). Окрашенные срезы просматривали флюоресцентным микроскопом (AxioScope A1, Zeiss) через набор фильтров №49 (фильтр возбуждения G 365 и излучения BP 445/50). Результаты.

Пищевод, выделенный от животных, непрерывно перфузировали детергентами SDS и Triton X100 с последующей обработкой трипсином и ЭДТА. Каждую группу анализировали сравнительно с нативной тканью и между собой. Образцы ткани анализировали после каждой обработки детергентом и трипсином или ЭДТА.

В ходе морфологического исследования децеллюляризированных образцов пищевода, при равных условиях и времени проведения опыта, было отмечено, что ткани после удаления клеток теряли характерный темно- красный цвет и приобретали молочно-белую окраску, присущую всем децеллюляризированным тканям. Ткань пищевода сохраняла эластичность и упругость. Однако во всех экспериментальных группах было выявлено увеличение размеров пищевода в диаметре, вследствие набухания ткани, по сравнению с нативным пищеводом (Рисунок 1).

Гистологические исследования показали наличие всех слоев в нативном пищеводе, то есть слизистую, подслизистую и внешний мышечный слой. Тогда как в экспериментальных группах обработанный пищевод имел схожую картину, но при отсутствии клеточных компонентов (Рисунок 2). Данные были подтверждены при окрашивании срезов ДНК- флуорохромом DAPI, которая окрашивает элементы ткани, содержащие ДНК. Как видно на рисунке 3, клеточныеэлементы сохранились только в нативном пищеводе (контроль).

Для количественного определения ДНК в ткани пищевода было проведено оценка его содержания с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК. В результате было установлено, что наименьшее содержание ДНК было в образцах, обработанных с Triton X100 с последующей обработкой ЭДТА. При этом количество ДНК было на 8 раз ниже по сравнению с контрольной группой (Pисунок 4).

Обсуждение и заключение.

Децеллюляризированные донорские органы не должны содержать клеток, включая клеточные компоненты: цитоплазму и ядра. Их присутствие в ВКМ может способствовать нарушению клеточной биосовместимости in vitro и вызывать побочные реакции в условиях in vivo при последующей рецеллюляризации (заселение клетками ткани). Поэтому основным этапом получения ВКМ является удаление всех клеточных элементов с помощью различных химических, биологических и физических методов.

В процессе обработки ткани агент для децеллюляризации должен быть в состоянии эффективно удалить все клетки и клеточные компоненты из ткани без изменения гистологической структуры и химического состава нативного ВКМ [13]. ВКМ играет важную роль в физиологии клеток и, следовательно, в функции и самой ткани. Было показано, что ВКМ обеспечивает средства, с помощью которых происходит коммуникация клеток [14], деление [15] и дифференциация [16]. Несмотря на то, что ВКМ существенно стимулируют репарацию ткани, успех их применения находится в сильной зависимости от способа их получения (метода децеллюляризации), который при условиях, подобранных неудачно, может приводить к потере механических и биологических свойств. Условия должны подбираться с учетом особенностей ткани: плотности, толщине, содержанию липидов и т.д. Также необходимо учитывать, что каждый агент, используемый для децеллюляризации, повреждает ВМК в той или иной степени, и речь идет лишь о минимизации последствий. Кроме того, как было показано ранее, технологию децеллюляризации для одних видов животных не всегда можно использовать для других [17].

Исследования в области децеллюляризации пищевода проводятся в основном на грызунах, гистологическая и макроструктура пищевода которых отличается от человеческой [1, 11, 12]. Кроме того, преобладающим способом обработки ткани является перемешивание его в растворах с детергентами или ферментами. Однако недавние исследования показали об успешном применении перфузии органов с помощью указанных выше растворов [1, 18]. Поэтому в наших исследованиях было отдано предпочтение этому методу вследствие его простоты и беспрепятственного доступа для обработки, как внутренней слизистой, так и внешней оболочки пищевода.

Результаты морфологических методов исследования показали отсутствие клеток и сохранность ВКМ. В ходе проведенных исследований было установлено, что при децеллюляризации не происходило повреждения целостности ВКМ и наиболее оптимальным методом децеллюляризации пищевода овец является обработка 0,6 % Triton X100 в течение 24 ч и 5 мМ ЭДТА в течение 12 ч. В некоторых исследованиях были использованы высокие концентрации Triton X100 (1,0%) и длительное время обработки (72 ч) [11, 12]. При этом был использован метод перемешивания и возможно вследствие слипания пищевода внутренний слой не полностью обрабатывался детергентом. Таким образом, был получен бесклеточный матрикс пищевода с сохраненной структурой и незначительным содержанием ДНК. Последующее заселение такого каркаса стволовыми или дифференцированными клетками пациента, даст возможность получить искусственный орган или ткань с минимальным риском отторжения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sjöqvist S., Jungebluth P., Lim M.L. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats // Nat. Commun. - 2014. -V. 5. - N. 3562. - P. 1-15.
2. Арзыкулов Ж.А., Ермекбаева Б.Е., Сейтказина Г.Д., Науанова Л.Т. Показатели онкологической службы Республики Казахстан за 2000 год (статистические материалы) // Алматы: 2001. - 48 с.
3. Мухитдинова И.Н., Абдурахманов Б.А., Арыбжанов Д.Т. и соавт. Динамика заболеваемости и результаты лечения больных раком пищевода // V Съезд онкологов и радиологов Республики Казахстан с международным участием. - 2014. - 29-30 апреля. - № 78.
4. Poghosyan, T. et al. Functional disorders and quality of life after esophagectomy and gastric tube reconstruction for cancer // J. Visc. Surg. - 2011. - V. 148. - P. 327-335.
5. Cowles, R. A. & Coran, A. G. Gastric transposition in infants and children // Pediatr. Surg. Int. - 2010. - V. 26. - P. 1129-1134.
6. Smithers, B. M., Gotley, D. C., Martin, I. & Thomas, J. M. Comparison of the outcomes between open and minimally invasive esophagectomy // Ann. Surg. - 2007. - V. 245. - P. 232-240.
7. Stein, H. J. et al. Early esophageal cancer: pattern of lymphatic spread and prognostic factors for long-term survival after surgical resection // Ann. Surg. - 2005. - V. 242. - P. 566-573.
8. Teebken, O.E., Bader, A., Steinhoff, G., and Haverich, A. Tissue engineering of vascular grafts: human cell seeding of decellularised porcine matrix // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. - 2000. - V. 19. - P. 381-386.
9. Schmidt C.E., and Baier J. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering // Biomaterials. - 2000. V. 21. - P. 2215-2231.
10. Badylak S. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction // Semin. Cell Develop. Biol. - 2002. - V. 13. - P. 377-383.
11. Ozeki M, Narita Y, Kagami H, Ohmiya N, Itoh A, Hirooka Y, et al. Evaluation of decellularized esophagus as a scaffold for cultured esophageal epithelial cells // J Biomed Mater Res A. - 2006. - V. 79(4). - P. 771-778.
12. Bhrany AD, Beckstead BL, Lang TC, et al. Development of an esophagus acellular matrix tissue scaffold // Tissue Eng. - 2006. - V. 12. - P. 319-30.
13. Gilbert T.W., Sellaro T.L., Badylak S.F. Decellularization of tissues and organs // Biomaterials. - 2006. - V. 27. - P. 3675-3683.
14. Badylak S.F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material // Biomaterials. - 2007. - V. 28. - P. 3587-3593.
15. Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes // Biomaterials. - 2011. - V. 32. P. 3233-3243.
16. Cortiella J., Niles J., Cantu A., Brettler A., Pham A. et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng Part A. - 2010. - V. 16. - P. 2565-2580.
17. Petersen T.H., Calle E.A., Zhao L. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation // Science. - 2010. - V. 329(5991). - P. 538-541.
18. Totonelli G., Maghsoudlou P., Georgiades F. Et al. Detergent enzymatic treatment for the development of a natural acellular matrix for oesophageal regeneration // Pediatr Surg Int. - 2013. - V. 29(1). - P. 87-95.