Валидация уф-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови: прецизионность

Подходы к процедуре определения и оценке приемлемости прецизионности УФ-спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе, предложенные авторами в предыдущей работе, апробированы на примере УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови.

Введение. Данная статья является продолжением работы авторов [1 - 4, 6, 7] в области разработки подходов к валидации методик количественного определения для целей судебно-токсикологического анализа и посвящена вопросам разработки процедуры определения и формирования критериев приемлемости для валидационного параметра «прецизионность».

Целью данной работы является апробация подходов к процедуре определения и оценке приемлемости прецизионности УФ-спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе, предложенных в нашей предыдущей работе [4], на примере УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови.

Материалы и методы исследования. Рабочие растворы: 1000,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 250,0 мл, растворяли в воде очищенной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 1, концентрация 4000 мкг/мл). В семь мерных колб емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 32,50; 30,00; 25,00; 20,00; 15,00; 10,00 и 5,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 1 соответственно и доводили объемы растворов водой очищенной до метки (рабочие растворы 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 соответственно, концентрация 1300, 1200, 1000, 800, 600, 400 и 200 мкг/мл соответственно).

400,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 100,0 мл, растворяли в воде очищенной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 2, концентрация 4000 мкг/мл). В пять мерных колб емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 32,50; 30,00; 20,00; 10,00 и 5,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 2 соответственно и доводили объемы растворов водой очищенной до метки (рабочие растворы 8, 9, 10, 11 и 12 соответственно, концентрация 1300, 1200, 800, 400 и 200 мкг/мл соответственно).

Модельные растворы: 100,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 500,0 мл, растворяли в 0,1 моль/л растворе кислоты хлористоводородной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 3, концентрация 200 мкг/мл). В семь мерных колб емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 26,00; 24,00; 20,00; 16,00; 12,00; 8,00 и 4,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 3 соответственно и доводили объемы растворов 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки (модельные растворы 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 соответственно, концентрация 52, 48, 40, 32, 24, 16 и 8 мкг/мл соответственно).

Раствор сравнения: 400,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 100,0 мл, растворяли в 0,1 моль/л растворе кислоты хлористоводородной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 4, концентрация 4000 мкг/мл). В мерную колбу емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 18,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 4 и доводили объем раствора 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки (стандартный раствор 5, концентрация 720 мкг/мл). В мерную колбу емкостью 50,0 мл вносили 2,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 5 и доводили объем раствора 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки (раствор сравнения, концентрация 28,8 мкг/мл).

Калибровочные образцы: 3 серии по 7 образцов (20,00 мл) модельной крови (матрица), полученной от 3 различных источников, в которые введено по 1,00 мл рабочих растворов 1 - 7 соответственно.

Модельные образцы: 3 серии по 5 образцов (20,00 мл) модельной крови, полученной от 3 различных источников, в которые введено по 1,00 мл рабочих растворов 8-12 соответственно;

Анализируемые растворы: полученные по валидируемой методике [3] растворы для калибровочных и модельных образцов.

Измеряли оптическую плотность анализируемых растворов, модельных растворов и раствора сравнения по 3 раза с выниманием кюветы при длине волны 262 нм на спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве компенсационного раствора использовали 0,1 моль/л раствор кислоты хлористоводородной.

Результаты исследования и их обсуждение. Ранее [4] нами были предложены следующие критерии и процедура оценки приемлемости прецизионности УФ- спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе:

  • применение нормализованных координат;
  • подтверждение прецизионности методики проводят в двух направлениях - на модельных растворах (без матрицы) и на образцах матрицы;
  • проверку прецизионности методики по модельным растворам проводят путем расчета их концентрации с использованием соответствующей линейной

model

зависимости; полученные значения calc , %

используют для расчета

model

RR , % и

model

sa mp le ;

model

sample предложены критерии

приемлемости в рамках двух подходов, основанных на: 1) предположении равенства неопределенности процедуры пробоподготовки и неопределенности количественного определения аналита в модельных ∆ model

sample ≤ 10,00%); 2) предположении

незначимости неопределенности количественного model sample ≤ 4,52%);

  • оценку прецизионности методики на образцах матрицы проводят на двух уровнях - within-run и between-run - с использованием калибровочных и модельных образцов;
  • определение within-run прецизионности проводят путем расчета концентрации калибровочных образцов для каждой последовательности по индивидуальным значениям оптической плотности с использованием линейной зависимости, полученной для данной последовательности; полученные значения Xcalc, % используют для расчета RR, % и Δsample, для оценки которой предложен следующий критерий приемлемости:

≤ max∆ ‚ = 0,707 · max ∆. = 14,14%;

sa mp le sa mp le As

• определение between-run прецизионности проводят в три этапа - рассчитывая разность между средними RR, % значениями

в разные дни (она не должна превышать 4,52%), а также рассчитывая концентрации модельных образцов и средние концентрации калибровочных образцов с использованием линейной зависимости, полученной по средним значениям параллельных последовательностей;

  • исследования модельных образцов проводят для трех параллельных последовательностей/run, образцы биологической матрицы для которых получены из различных источников; для D = 25 - 125% каждая последовательность состоит из 3 модельных образцов (концентрации соответствуют точкам 25%, 50% и 100% в нормализованных координатах), для D = 25 - 150% и 25 - 175% - из 4 образцов (концентрации соответствуют точкам 25%, 50% и 150% или 175% соответственно в нормализованных координатах);
  • полученные значения Xcalc, % для модельных и калибровочных образцов используют для расчета RR, %, intra

а также величин sample и Δsample, для оценки которых intra предложены критерии приемлемости ( sample ≤ 20,00% и Δsample ≤ 14,14%).

Для иллюстрации предложенных подходов к определению и оценке прецизионности использовали УФ- спектрофотометрическую методику количественного определения доксиламина в крови [3]; за 100% принимали летальную концентрацию доксиламина в крови [5] - 25 мг/л (что соответствует 36 мг/л доксиламина сукцината).

В табл. 1 приведены результаты измерений значений оптической плотности модельных растворов, рассчитанные значения концентраций модельных растворов и величины RR, % для различных диапазонов применения методики. Данные model таблицы 1 относительно величины sample , % свидетельствуют, что требования к сходимости результатов выдерживаются и для Подхода 1, и для Подхода 2.

В таблице 2 - 3 приведены результаты измерений значений оптической плотности для калибровочных и модельных образцов, соответствующие им значения Xcalc, % и величины RR, % для различных диапазонов применения методики. Из приведенных в табл. 2 - 3 данных видно, что требования к сходимости и внутрилабораторной прецизионности выполняются для всех предложенных вариантов диапазонов применения методики и для обоих вариантов методики - с ТСХ-очисткой и без нее.

Для диапазона применения 25 - 125% в случае выполнения анализа без предварительной ТСХ-очистки величина intra sample достигает критических величин - 19,54%, поэтому для данного варианта методики лучше пользоваться более широким диапазоном применения.

Необходимо отметить, что в целом методики с выполнением предварительной ТСХ-очистки обладают лучшей внутрилабораторной прецизионностью и худшей сходимостью, чем методики без ТСХ-очистки, что объясняется введением дополнительных стадий пробоподготовки, естественным образом ухудшающих within-run прецизионность (оценивающую, в первую очередь, случайную ошибку, вносимую пробоподготовкой), но нивелирующих влияние смены источника происхождения матрицы на результаты анализа за счет более качественной очистки пробы (и тем самым улучшающих between-run прецизионность).

Выводы. Подходы к процедуре определения и оценке приемлемости прецизионности УФ-спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебнотоксикологическом анализе, предложенные в нашей предыдущей работе [4], апробированы на примере УФ- спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови. Полученные результаты показали адекватность сформированных подходов.

Таблица 1 - Результаты определения прецизионности УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина сукцината по модельным растворам

Фактическая концентрация доксиламина сукцината в модельном растворе (Ģ¡ţ = 28,8 мкг/мл)

Оптическая плотность (.%- = 0,801)

Найдено в % к стандартной оптической плотности

model γi , %

Рассчитанная концентрация доксиламина сукцината в модельном model растворе X i,calc , %

model

RR % = i,calC ·1〇〇

γ- model X i , fa ct

model Ci , fa ct ,

мкг/мл

model

X i , fa ct %

D = 25 - 175% (g = 7)

8,00

27,78

0,226

28,21

28,35

102,05

16,00

55,56

0,444

55,43

55,70

100,26

24,00

83,33

0,657

82,02

82,42

98,91

32,00

111,11

0,890

111,11

111,66

100,49

40,00

138,89

1,121

139,95

140,64

101,26

48,00

166,67

1,348

168,29

169,12

101,47

52,00

180,56

1,421

177,40

178,27

98,73

RR model %

100,45

RSDR°del,l

1,27

∖ ∖ -'% = x = RSDRRdel · 1,943

подход 1

≤ 10,00%

2,47

подход 2

≤ 4,52%

D = 25 - 150% (g = 6)

8,00

27,78

0,226

28,21

27,90

100,43

16,00

55,56

0,444

55,43

54,82

98,67

24,00

83,33

0,657

82,02

81,12

97,34

32,00

111,11

0,890

111,11

109,89

98,90

40,00

138,89

1,121

139,95

138,41

99,65

48,00

166,67

1,348

168,29

166,44

99,86

RR model %

99,14

RSDR°del,l

1,09

NmadR1le,% = XRRel = RSDRRdel · 2,015

подход 1

≤ 10,00%

2,20

подход 2

≤ 4,52%

D = 25 - 125% (g = 5)

8,00

27,78

0,226

28,21

28,07

101,04

16,00

55,56

0,444

55,43

55,15

99,27

24,00

83,33

0,657

82,02

81,61

97,94

32,00

111,11

0,890

111,11

110,56

99,50

40,00

138,89

1,121

139,95

139,25

100,26

RR model %

99,60

RSDR°dd,,

1,16

ă model q/ tmodel τ)C∣τ∖model ɔ 1 ɔ-ɔ

ample,% = RSDrr · 2,132

подход 1

≤ 10,00%

2,47

подход 2

≤ 4,52%

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Клименко, Л. Ю. Анализ подходов к определению специфичности / селективности при проведении валидации аналитических методик в судебно-токсикологическом анализе. // Укр. мед. альм. – 2013. – Т. 16. - №1. – С. 47 – 49.
  2. Клименко, Л. Ю. Подходы к определению специфичности / селективности при валидации УФ-спектрофотометрических методик количественного определения в судебно-токсикологическом анализе / Л. Ю. Клименко, Г. П. Петюнин, Т. А. Костина // Фармация Казахстана. – 2013. – №8. – С. 53 – 56.
  3. Л. Ю. Клименко, С. Н. Трут, Г. П. Петюнин, И. М. Иванчук Модификация и валидация УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови: специфичность // Укр. журн. клін. та лаборатор. медицини. – 2013. – Т. 8. - №4. – С. 191 – 199.
  4. Klimenko, L. Yu. Approaches to determination of precision for UV-spectrophotometric methods of quantitative determination in forensic and toxicological analysis // Фармация Казахстана. – 2014. – №3. – С. 43 – 50.
  5. A. C. Moffat, M. D. Osselton, B. Widdop Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. – London: Pharmaceutical Press, 2011. – 2609 p.
  6. L. Yu. Klimenko, S. M. Trut, G. P. Petyunin, I. M. Ivanchuk Validation of UV-spectrophotometric methods of quantitative determination in forensic and toxicological analysis: recovery // Фармация Казахстана. – 2013. – №12. – С. 42 – 48.
  7. Klimenko, L. Yu. Development of approaches to validation of UV-spectrophotometric methods of quantitative determination in forensic and toxicological analysis: linearity and range // Фармацевтичний часопис. – 2014. – №1 (30). – С. 41 – 48.
Год: 2014
Город: Алматы
Категория: Медицина