Оценка антимутагенной активности масляных фитоэкстрактов при комбинированном действии хрома и бора

При профилактическом применении препараты «Крапивы масло», «Лопуха корня масло» и «Шукур май» обладают антимутагенной активностью, проявляющейся в снижении генотоксических эффектов в соматических и половых клетках крыс-самцов, индуцированных комбинированным воздействием бихромата калия и борной кислоты. Одним из базисных механизмов антимутагенного эффекта является способность каждого фитоэкстракта ингибировать процессы перекисного окисления липидов и стимулировать антиоксидантную систему организма.

Одной из актуальной и вместе с тем менее разработанной проблемой современной профилактической медицины является поиск, разработка и внедрение лекарственных средств, обладающих антимутагенной активностью. Потребность в них в связи с возрастающей нагрузкой генотоксических факторов на популяции человека и животных исключительна велика. Общеизвестно, что генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенами имеют значение для здоровья современного и будущего человечества. Вследствие увеличения мутационного груза популяций человека возрастает число наследственных заболеваний, болезней с генетической предрасположенностью, злокачественных новообразований, количество спонтанных абортов и бесплодных браков. Мутационные повреждения также приводят к сокращению продолжительности жизни, и преждевременному старению организма.

Следовательно, при комплексной оценке влияния вредных агентов на живые организмы особое место занимают повреждения генетических структур.

Бесспорно, что полностью изолировать наследственные структуры от отрицательного действия огромного количество генотоксикантов не представляется возможным. Проблема изучения отдаленных последствий химических веществ на организм человека особенно актуальна для Западного Казахстана, в том числе и для такого промышленного города как Актобе, т.к. Актюбинская область является природной борно- хромовой биогеохимической провинцией. Соединения шестивалентного хрома (Cr⁺⁶) вызывают профессиональные заболевания, генотоксичны, канцерогены, соединения бора обладают гонадо-, эмбриотоксичностью. Соединения обоих химических элементов входят в перечень по действию на репродуктивную функцию человека *1+. В связи с этим большой научно-практический интерес представляет модификация индуцированного мутагенеза, которая может осуществляться путем антимутагенеза и комутагенеза.

С этой точкой зрения перспективным источником антимутагенов является растительные и синтетические средства, обладающие антимутагенной активностью в условиях, особенно, комбинированного, комплексного сочетанного воздействия поллютантов на организм.

В последнее время широкое применение в медицине находят масляные экстракты из лекарственного растительного сырья, имеющих ряд преимуществ по сравнению с водными и спиртовыми извлечениями. Одними из таковых являются полифитовое масло «Шукур май» (РК-ЛК-5-№014855), в состав которого входят корни солодки, лопуха, ревеня и листья крапивы, «Крапивы масло» (РК-ЛК-5-№014181) и «Лопуха корня масло» (РК- ЛК-5-№014181). Экспериментальными исследованиями установлено, что масляные экстракты крапивы *2+, корня ревеня *3+ обладают антиоксидантным действием, препараты «Масло корня лопуха», «Масло солодки» проявляют антимутагенные свойства в условиях избыточного поступления в организм Cr⁺⁶ *4+, а ПФМ «Шукур май» - в условиях комбинированного действия хрома и бора *5+.

Вышеизложенные факты и отсутствие в научной литературе данных об антимутагенных и антиоксидантных свойствах препаратов из масляных экстрактов листьев крапивы и корня лопуха при комбинированном воздействии соединении хрома (Cr⁺⁶) и бора (борной кислоты и других), послужили основанием для изучения влияния фитоэкстрактов на индуцированные комбинацией бихромата калия и борной кислоты мутации. Оценить антимутагенную активность по состоянию цитогенетических нарушений и перекисного гомеостаза у крыс.

Материалы и методы. Работа выполнена на крысах обоих полов линии «Wistar» массой 180-240 г. Животные содержались в виварии при естественной освещенности и максимальной стандартизации температурного и пищевого режимов со свободным доступом к еде и воде. Исследования проводились в первой половине дня (9-12 часов). Все манипуляции были проведены в соответствие с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте *6+. Программа эксперимента обсуждена и одобрена региональной этической комиссией университета.

Для оценки мутагенной и антимутагенной активности изучаемых веществ в соматических клетках использовали один из широраспространенных методов учета цитогенетических нарушений микроядерный тест – метод определения частоты микроядер в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга in vivo. Метод рекомендован в качестве основного для проведения скрининг мутагенов и антимутагенов среди фармакологических соединений *7+ и включен как обязательный при токсикологических исследованиях в странах Европейского экономического сообщества и Японии *8+.

Для определения мутаций в зародышевых клетках и оценки антимутагенной активности исследуемых фитоэкстрактов использован метод определения доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в половых клетках самцов при воздействии мутагенов, проявляющихся в первом поколений. Частоты ДЛМ учитывают по повышению эмбриональной смертности у интактных беременных самок, спаренных с подопытными самцами. По данным Абилова С.К. (2003) тест на доминантную летальность более эффективен, чем тест на цитогенетические нарушения в соматических клетках *9+.

Исследования проведены в два этапа. На первом этапе эксперимента использованы крысы - самцы, которые были разделены на 5 групп (по 10 крыс в каждой группе): первая группа - интактные; животным 2-5 групп была введена однократно внутрибрюшинно инъекция бихроматом калия (K₂Cr₂O₇) (приобретен в ТОО «Химия и Технология», Казахстан, г.Алматы) в дозе 14 мг/кг массы тела (0,05 LD50) и борной кислотой (H3BO3) (приобретена у ОАО «Фармак», Украина, г.Киев) в дозе 12,5 мг/кг (0,05 LD₅₀). Крысы - самцы второй - пятой групп до введения [K2Cr2O7+H3BO3+ в течение 2-х недель (14 дней) внутрижелудочно через зонд получали соответственно подсолнечное масло «Олейна» (контрольная группа), ПФМ «Шукур май», препараты «Крапивы масло» и «Лопуха корня масло» в лечебно-профилактической дозе 2,5 мл/кг. м.т. один раз в сутки. Часть крыс-самцов через 24 часа после введения *K2Cr2O7+H3BO3+ подвергали тестированию; другую часть использовали для постановки теста ДЛМ в половых клетках, т.е. для спаривания с интактными самками.

Собранную кровь использовали для оценки состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантного статуса (АОС). Уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты *10+, содержание сульфгидрильных SH-групп в сыворотке крови - по методу Ellman *11+, в эритроцитах активность каталазы (КАТ) - методом Королюк М.А. и соавт *12+, супероксиддисмутазы (СОД) - по методу Beauchamp C., Fridovich I. *13+. Вычисляли соотношение ^{СОД*КАТ}/_МДА и ^śн/_Мд_А, отражающее сбалансированность перекисного гомеостаза. Учет частоты микроядер (МЯ) в клетках костного мозга, полученных из трубчатых костей задней конечности крыс-самцов, производили по общепринятой методике *14+. Общий белок определяли по методу Лоури *15].

На втором этапе исследования вторую половину крыс- самцов (по пять в каждой группе) на 15-й день исследования использовали для изучения мутагенной и антимутагенной активности исследуемых веществ в половых клетках в тесте ДЛМ. К каждому самцу на недельный срок подсаживали интактных самок в отношении 1:2. По наличию сперматозоидов во влагалищном мазке судили о наличии беременности. Подсадку самок проводили только на стадии зрелых сперматозоидов (I неделя) сперматогенеза у самцов с учетом результатов наших предыдущих исследовании *5+. Беременных самок отсаживали в отдельную клетку, где они находились до забоя. На 17-й день беременности самок выводили из эксперимента методом декапитации под легким эфирным наркозом и вскрывали брюшную полость, матку и анализировали эмбриональный материал: подсчитывали желтые тела беременности, число мест имплантации, количество живых и мертвых эмбрионов. Определяли до-, постимплантационную смертность, общую эмбриональную смертность (ОЭС), частоту доминантных летальных мутаций, антимугенный эффект (АМЭ) исследуемых масляных фитоэкстрактов общеизвестными методами *16+. Результаты выражены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Существенность средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Уилкоксона-Манна-Уитни. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05 *17+.

Результаты и их обсуждение. Анализ результатов влияния фитомасел на цитогенетические эффекты в соматических клетках, индуцированные комбинацией [K2Cr2O7+H3BO3+ (таблица 1) показывает, что однократное совместное введение экотоксикантов (контрольная группа) приводит к увеличению частоты МЯ в ПХЭ костного мозга в 6,74 раз. При профилактическом применении в течение 2-х недель «Шукур май», препаратов «Крапивы масло» и «Лопуха корня масло» в условия комбинированного воздействия *K2Cr2O7+H3BO3] наблюдается снижение частоты МЯ в ПХЭ соответственно на 55, 75,3 и 79,3% по сравнению с данными контрольной. АМЭ составил 57,4, 76,6 и 80,4% соответственно. Наибольшей антимутагенной эффективностью в отношении соматических клеток обладает «Лопуха корня масло», наименьшей - «Шукур май».

Таблица 1 - Влияние фитоэкстрактов на цитогенетические эффекты в соматических клетках, индуцированные
комбинированным воздействием бихромата калия и борной кислоты

Примечание: ПМ – подсолнечное масло «Олейна»; K2Cr2O7 - бихромат калия; H3BO3 - борная кислота; ШМ – «Шукур май»; КМ – «Крапивы масло»; ЛКМ – «Лопуха корня масло»; * - р<0,001 по отношению к интактной; º - р<0,001 по отношению к контрольной группе.

При исследовании эмбрионального материала установлено, что комбинированное воздействие изучаемых химических веществ (контрольная группа) вызывает многократное повышение ОЭС (в опыте 81,0±7,0 напротив интактной - 9,0±0,53) в основном за счет постимплантационной смертности - ПИС (61±6,9 против 6,72±0,52 в интактной). Общие потери зигот были 9 раз выше, чем в интактной группе. Доимплантационная смертность (ДИС) увеличилась в 8,7 раз. Частота доминантных летальных мутаций составила 0,63.

Анализ экспериментального материала самок, оплодотворенных самцами, которые до воздействия комбинацией *K₂Cr₂O₇+H₃BO₃+ в течение 14 дней получали «Шукур май», «Крапивы масло» и «Лопуха корня масло» показывает, что уровень ОЭС снижается соответственно на 60,5, 69,5 и 76,8%, ДИС - на 67,5, 54,5 и 89%, ПИС - на 58,5, 73,3 и 73% по сравнению с данными контрольной группы. Частота ДЛМ равняется 0,42; 0,30 и 0,23 соответственно, т.е. уменьшается на 33,3; 53,4; 63,5%. АМЭ по постимплантационной смертности составляет 58,7; 73,4 и 73%, по доимплантационной - 70, 58 и 90%, по общей эмбриональной гибели - соответственно 61, 70 и 77%. Наибольшую антимутагенную активность по всем показателям эмбриональных потерь показала «Лопуха корня масло», наименьшую по ОЭС и ПИС - «Шукур май», по ДИС - «Крапивы масло».

К настоящему времени собрано достаточно сведении о значении свободных радикалов в механизме развития индуцированных мутаций. Кроме того установлена положительная корреляция между антимутагенными и антиоксидантными свойствами ряда природных соединений, среди которых важное место занимают лекарственные растения *18+. В связи с этим, у исследуемых препаратов изучили влияния их на состояние ПОЛ и АОС в условиях комбинированного воздействия.

В таблице 2 приведены результаты, характеризирующие ПОЛ и АОС у крыс-самцов, получавших исследуемые масляные фитоэкстракты в профилактическом режиме в условиях комбинированного воздействия бихроматом калия и борной кислотой.

Таблица 2 - Влияние фитоэкстрактов на перекисной гомеостаз у крыс при комбинированном воздействий бихроматом
калия и борной кислотой

Примечание: * - р<0,001 по отношению к интактной; º - р<0,001 по отношению к контрольной группой; ПМ – подсолнечное масло; ШМ – «Шукур май»; КМ – «Крапивы масло»; МКЛ – «Масло корня лопуха»; СВ - K2Cr2O7+H3BO3; Z - СОД*КАТ ^/МДА.

Как видно из данных таблица 2, после однократного введения *K2Cr2O7+H3BO3+ происходит значительная активация процессов пероксидации липидов: количество МДА увеличивается на 136% на фоне снижения активности СОД на 56,7%, КАТ на 46%, содержания SH- групп на 42,6%. Интегральный показатель сбалансированности перекисного гомеостаза SH/МДА уменьшается на 76%. Профилактическое применение «Шукур май», «Крапивы масло» и «Лопуха корня масло» приводит к снижению МДА в плазме крови соответственно на 15, 19 и 29% на фоне увеличения SH- групп в крови на 43, 59 и 70,5% в сравнении с данными контрольной группы. Соотношение SH/МДА возрастает на 70, 99 и 143% соответственно. Активность эритроцитарных ферментов СОД повышается соответственно на 61, 73 и 84%, КАТ - на 45,5; 61 и 70%, СОД*КАТ что приводит к увеличению соотношения /_МДА на 176, 245 и 339,5%, отражающего сбалансированность в системе ПОЛ и антиоксидантная защита (АОЗ) в крови.

Таким образом, полученные результаты изучения ПОЛ- АОЗ показывает, что исследуемые препараты при профилактическом применении в течение 14 дней в дозе 2,5 мл/кг м.т. статистически значимо тормозили ПОЛ и активизировали АОЗ на модели оксидативного стресса, индуцированной комбинированным воздействием бихромата калия и борной кислоты. При этом наибольшую антиоксидантную активность по СОД*КАТ SH интегральным показателям ( /_МДА и /_МДА) показала препарат «Лопуха корня масло», наименьшую в условиях данного эксперимента - ПФМ «Шукур май».

Большинство ученых *19,20+ механизм генотоксического действия металлов переменной валентности (в том числе +6

Cr ) связывают с инициированием процессов образования активных форм кислорода, которые вызывают повреждения генетических структур *21,22+. Увеличения МДА является важным признаком окислительного стресса и повышенной ПОЛ в различных липидных системах организма *23+. В нашей работе все изучаемые фитопрепараты уменьшали уровень МДА в плазме крови. Комбинированные воздействия бихроматом калия и борной кислотой проводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и количества SH-групп в крови. При превентивном применении масляных фитоэкстрактов наблюдалось снижение мутагенного действия комбинации бихромата калия и борной кислоты в соматических (уменьшения частоты МЯ в ПХЭ), и половых (снижение эмбриональных потерь) клетках и активизация деятельности системы АОЗ крови (повышение СОД, КАТ в эритроцитах, SH-групп в крови). В самом деле, окислительный стресс развивается, когда уровень антиоксидантов уменьшено *24+. И следует отметить, что антиоксиданты (как ферментативные, так и неферментативные) может обеспечить защиту клеток человека от повреждающего действия металлоиндуцированных свободных радикалов [25].

Результаты проведенного нами исследования показывают, что «Шукур май», «Крапивы масло», «Лопуха корня масло» модифицируют генотоксические эффекты, индуцированные комбинированным воздействием бихромата калия и борной кислоты в соматических и половых клетках в сторону их снижения, что позволяет сделать заключение о наличии у исследуемых масляных фитоэкстрактов антимутагенной активности. Одним из механизмов ингибирующего влияния их на мутации, вызванные комбинацией этих химических веществ, заключается в антиоксидантных свойствах фитоэкстрактов. С учетом известных мембраностибилизирующих и антиоксидантных, и установленных в нашем исследовании антимутагенных, антиоксидантных свойств в условиях данного эксперимента, ПФМ «Шукур май», препараты «Крапивы масло» и «Лопуха корня масло» могут быть рекомендованы к применению в качестве средств защиты генетического аппарата.

Список литературы

1. Перечень веществ, продуктов, производственных процессов, бытовых и природных факторов канцерогенных для человека. Федеральные санитарные правила и гигиенические нормативы. ГН 1.1 029-95. – М.: 1995. – С. 3-7.
2. Искакова С.С. Модификация химического мутагенеза масляным экстрактом из листьев крапивы: автореф. … канд.мед.наук. – Актобе: 2008. - 24 с.
3. Нурбаулина Э.Б. Антиоксидантная активность масляного экстракта корня ревеня при лекарственных гепатитах (экспериментальное исследование): автореф. …канд.мед.наук. – Актобе: 2010. - 24 с.
4. Изтлеуов Е.М. Фармакологическая коррекция нарушений репродуктивной функции при избыточном поступлении шестивалентного хрома (экспериментальное исследование): автореф. … канд.мед.наук. – Актобе: 2007. - 24 с.
5. Изтлеуов Е.М., Изтлеуов М.К. Влияние масляных экстрактов из лекарственного растительного сырья на цитогенетические нарушения при комбинированном действии хрома и бора. // Материалы международной научнопрактической конференций «Наука в современном информационном обществе», 3-4 апреля 2013. – М.: 2013 - С. 86-89.
6. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. - Strasburg: Council of Europe. – 1986. – 48 p.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. – М.: 2005. - 832 с.
8. Колмакова Т.С., Белик С.Н., Моргуль Е.В., Севрюков А.В. Использование микроядерного теста для оценки эффективности лечения аллергии у детей. Методические рекомендации. – Ростов на Дону: Изд-во Рост ГМУ, 2013. – 31 с.
9. Абилов С.К. Выявление и прогнозирование мутагенной активности химических соединений окружающей среды: автореф. … докт.биол.наук. – М.: 2003. – 50 с.
10. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкин А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лабораторное дело. – 1988. - 11. – С. 41-43.
11. Ellman G.L. Tussue sulfhudryl groups // Arch. Biohem. Biophus. - 1959. №82. – Р.70-77.
12. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. – 1988. - №1. – С. 16-18.
13. Beauchamp C., Fridivich I. Superoxide dismutase: improved assays and assay applicable to acrylamids gels // Anal. Biochem. - 1971. – №44. Vol. 1. - Р. 276-287.
14. Журков В.С., Фельд Е.Г. Метод учета полихроматофильных эритроцитов с микроядроами в костном мозге млекопитающих // Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность. Методические указания. – Вильнюс. – 1989. - С. 21-23.
15. Lowry O.H., Rosebough N.J., Farr A.L. and R.J.Randal. Protein measurement with the Folin pheol reagent // J. Biol. Chem., 1951. – 193. – Р. 265-275.
16. Дурнев А.Д., Ревазова Ю.А., Верстакова О.Л. и др. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М.: 2000. – С. 47-60.
17. Плавинский С.Л. Биостатистика: планирование, обработка и представление результатов биомедицинских исследований при помощи системы SAS. – СПб.: Изд дом СПб МАПО, 2005. - 559 с.
18. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий). – М.: Медицина, 1998. – 328 с.
19. Aruldhas M.M., Subramanian S., Sekkar P. et all. Chronic chromium exposure-induced changes in testicular histoarchitecture are associated with oxidative strees: study in non-human primate // Hum.Reprod. – 2005. -20 (10). - Р. 2801-2813.
20. Wise S.S., Holmes A.L., Wise J.P.Sr. Hexavalent chromium – induced DNA damage and repair mechanisme // Rev. Environ. Health. – 2008. – 23(1). - Р. 39-577.
21. Goulart M., Baterou M.C., Rodrigues A.S., Laires A., Rueff J. Lipoperoxidation products and thiol antioxidants in chromium exposed workers // Mutagenesis – 2005. – 20. - Р. 311-315.
22. Xin Wang, Young - Ok Son, Qingshan Chang, Lijuan Sun, J. Andrew Hitron et al. 2011. NADPH Oxidase Activation Is Required in Reactive Oxygen Species Generation and Cell Trasformation Induced by Hexavalent Chromium. Toxicol Sci., 123 (2). – Р. 399-410.
23. Kaspercryk S., Kaspercryk J., Ostalowska A. et all. The role of the antioxidant enzymes in erythrocytes in the development of arterial hypertension among humans exposed to lead // Biol. Trace Elem. Res. – 2009. – 130. – Р. 95-106.
24. Tаpiero H., Townsend D.M., Tew K.D. The role of carotenoids in the prevention of human pathologes // Biomed. Pharomacother. - 2004. - 58. - Р.100-110.
25. Valko M., Morrish H., Cronin M.T. Metals, toxicity and oxidative stress // Curr. Med. Chem. - 2005. - #12. - Р. 1161-1208.