Применение противовирусных препаратов для снижения токсического действия пестицида

Представлены данные об антитоксическом действии противовирусных препаратов Индуктора интерферона бактериального жидкого и Антивирина- М в опытах in vitro- в культуре клеток и in vivo - на лабораторных животных. На модели хронической интоксикации пестицидом метсульфуронметилом у мышей опытной группы показано, что введение противовирусных препаратов способствует снижению токсического действия пестицида, повышению резистентности животных в ответ на введение летального вируса. Результаты могут быть использованы для поиска способов повышения устойчивости организма против токсического действия пестицидов.

Введение.

Среди экзогенных загрязнителей биосферы одно из ведущих мест занимают пестициды, широко используемые в современном агропромышленном производстве. Несмотря на строгие дозовые ограничения в применении, пестициды в виде остаточных количеств, либо продуктов разложения способны проникать в почву, воду, растения, кумулировать (накапливаться) в окружающей среде. Для населения контакт с пестицидами представляет потенциальную опасность для здоровья человека, что обусловлено употреблением продуктов питания животного и растительного происхождения [1, 2, 3].

За последние годы с целью уничтожения сорных растений и кустарников широко используются пестициды нового поколения. Особенностью новых пестицидов глифосата или метсульфуронметил является нечувствительность к ним генетически- модифицированных культур *4+. Токсическое действие новых пестицидов основано на ярко выраженном энзимопатическом эффекте, направленном на инактивацию основных ферментов, отвечающих за весь цикл роста и развития растений. Что касается изучения механизма действия пестицидов на клетки животного происхождения, было исследовано показано их влияние на угнетение активности важнейшего клеточного фермента- ацетилхолинэстеразы *5, 6, 7+.

Действие пестицидов нового поколения на факторы иммунной системы, в частности, на активность выработки интерферона мало изучено. На примере глифосата было показано угнетение продукции эндогенного ɑ/ß- интерферона *8+. Роль интерферона в организме чрезвычайно важна, по сути интерферон является природным противовирусным антибиотиком широкого спектра действия. Его функция осуществляется в организме группой низкомолекулярных гликопротеидов: α-, β- и γ- , различающихся по массе. Продукция α- интерферона в организме закодирована в 20 генах, ß- в 5-; ү-интерферон -представлен одним геном. Лейкоциты вырабатывают, главным образом, α - интерферон, тогда как β- образуется в- фибробластах; γ- интерферон- является продуктом Т-хелперов и макрофагов. В то же время, вероятно, синтезировать эти молекулы способны все содержащие ядро клетки *9+.Однако роль интерферона не ограничена только одним противовирусным действием - она более широка и направлена на выполнение других важнейших функций иммунитета: противоопухолевых, противовоспалительных, радиопротективных, иммуномодулирующих и иммуностимулирующих. Другими словами интерферон является важнейшим цитокином, медиатором большинства реакций иммунитета, в том числе и клеточного неспецифического. Интерферон продуцируется в первые часы после проникновения в организм любых агентов, содержащих чужеродную ДНК, патогенных вирусы, бактерии и др. что стимулирует дерепрессию генов интерферона, их активацию, в результате чего запускается каскад неспецифических реакций первичного иммунного ответа, направленный, в основном, на уничтожение и элиминацию возбудителя, задолго до появления специфических антител *10+. Механизм противовирусного и противоопухолевого действия интерферона един: он основан на способности интерферона усиливать активность клеточных ферментов : 2'5' олигоаденилатсинтетаз - катализаторов синтеза олигонуклеотидов, которые активируют действие клеточных ферментов эндонуклеаз, в результате чего последние , через цепь событий, ингибируют клеточную пролиферацию (отсюда - противоопухолевое действие интерферона), целью которой является деградация вирусной РНК *11+.

Следует подчеркнуть, что любое неблагоприятное воздействие на организм вредных факторов экзо- или эндогенного происхождения приводит к иммуносупрессии, в результате чего способность клеток к продукции интерферона снижается. Так, при хронической интоксикации иммуносупрессия является основным лабораторно-клиническим признаком, ведущим к снижению резистентности организма ко многим заболеваниям - от онкологических до различного рода инфекционных *12+.

В этой связи обоснована попытка применения препаратов, повышающих продукцию эндогенного ɑ/ß- интерферона с целью восстановления защитной функции клеток от токсического действия пестицида.

Материалы и методы.

Пестицид Для создания модели хронической интоксикации пестицидом был использован пестицид метсульфуронметил (МСМ).- метил-сульфурон-метил пестицид гербицидного действия (0,600 WG.2012-02-21 Polgar agrochem.Ltd.Herbicide; Monitor WG). Применяли растворы МСМ, приготовленные, ex tempore, из сухих гранул на основе физиологического раствора.

Противовирусные препараты Для стимуляции интерферонообразования использовали препараты:

Индуктор интерферона бактериальный жидкий (ИИБЖ) и препарат Антивирин-М. Препараты разработаны в НЦ гигиены и эпидемиологии им. Хамзы Жуматова МЗ РК. Препарат ИИБЖ зарегистрирован в Госреестре Республики Казахстан (АНД 42-33-68-11 (19.01.12г.); Антивирин-М – препарат, разработанный из отходов пчеловодства. Применяли 20% экстрагирующий раствор в авторской модификации. Препарат прошел все этапы доклинических испытаний [13].

Клетки. Использовали гомологичные монослойные культуры клеток мышиных фибробластов L929 и первично-трипсинизированные культуры клеток фибробластов эмбрионов мыши (ФЭМ), выращенные в 25см³ флаконах («Beckman Dickinson») в ростовой среде RPMI-1640 («Sigma»), с 10% телячьей эмбриональной сывороткой (« Lonza»), с глютамином 1мМ и гентамицином 100 мкг/мл (Gibco»). При пассажах клетки снимали с матраса раствором версена 1:4 («ПанЭко») и трипсина 0,25% («Самсон-Мед».

Животные. В опытах были использован белые лабораторные мыши массой 25-30г.

Вирусы. В качестве тест-вируса для определения продукции индукции интерферона, а также для моделирования летальной вирусной инфекции у мышей применяли вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС). Для изучения антителообразования у мышей использовали вирус гриппа гриппа А/ Aichi (H3N2). Для индукции интерферона использовали Вирус болезни Ньюкасл (ВБН). Все вирусы применяли соответственно в титре не менее 4,0-5,0 lg ТЦПД50. или 10^4,5 ЭИД50 . Препараты и вирусы вводили животным внутрибрюшинно, подкожно, интраназально, либо per os.

Титрование интерферона проводили микрометодом в культуре гомологичных клеток. Активность интерферона определяли по подавлению цитопатогенного действия (ЦПД50) вируса ЕМС *14+.

Титрование противогриппозных антител проводили микрометодом в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с 1% взвесью куриных эритроцитов. Для инактивации термолабильных ингибиторов сыворотки животных прогревали при 60ºв течение 30'. Для инактивации термостабильных ингибиторов сыворотки обрабатывали перийодатом калия.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью программ Statistica. считали Достоверными считали различия, отличающиеся от контрольных значений на величину p< 0,05 [ 15 ].

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Действие препаратов ИИБЖ и Антивирина М на хроническую интоксикацию пестицидом метсульфуронметилом (МСМ).

Для создания модели хронической интоксикации МСМ использовали группу мышей из 40 особей. Животных разделили на 4 подгруппы ( по 10 в каждой). Подгруппы 1-я, 2-я и 3-я получали ежедневно подкожно МСМ в течение 25 дней. Цитотоксическая доза МСМ (ЦТД50) была определена предварительным испытанием пестицида на клетках ФЭМ Применяли среднюю 50% дозу пестицида не вызывающую цитодеструкции (ЦТД₅₀) в течение 48 час, равную 0,025 мкг/мл * 8 +.

Мыши 1-й и 2-й подгрупп получали МСМ и , соответственно, ИИБЖ и Антивирин - М. ИИБЖ вводили подкожно, по 0,5 мл, через день. Антивирин-М - по 1,0 мл , per os, ежедневно. 3-я группа –получала МСМ, без введения ИИБЖ и Антивирина- М. 4-я группа (контроль) получала плацебо- по 0,5мл, через день физ.р-р. Затем животным всех групп вводили внутрибрюшинно , по 1,0 мл вирус- индуктор интерферона - ВБН. Через 6-8 час у мышей получали кровь, отделяли сыворотку и использовали для изучения активности - α^ – интерферона.

Результаты отражены в сводной Таблице, графа I. Как видно из представленных данных у животных 3-й основной опытной подгруппы при длительном введении МСМ наблюдались признаки иммуносупрессии, что проявлялось в снижении продукции интерферона до 54±12,1 МЕ/мл. Одновременное с МСМ введение мышам 1-й и 2-й подгрупп, соответственно, ИИБЖ и Антивирина-М, не только преодолевало иммуносупрессорное действие МСМ, но, кроме того, увеличивало количество интерферона - до 246,0 +13,2 МЕ/мл в сравнении с контролем - 7,2+12,4 МЕ/мл ( 4-я подгруппа).

Таблица 1 – Влияние индукторов интерферона на процесс интерфероно- и антителогенеза у мышей, подвергнутых
действию МСМ

Обозначения: *- обратные средние величины титров интерферона в международных единицах МЕ/мл. **-обратные среднегеометрические величины титров антител в ед/мл.

Влияние ИИБЖ и Антивирина-М на иммуносупрессорное действие МСМ и на формирование специфического иммунитета ( продукцию антител к вирусу гриппа А/ Aichi (H3N2).

Группу мышей (32 особи по 8 мышей в каждой подгруппе ) подвергали действию МСМ по вышеописанной схеме. Через 28 и 35 дней от начала введения МСМ и препаратов ИИБЖ и Антивирина-М всех животным внутрибрюшинно, по 1,0 мл вводили вирус гриппа А/ Aichi. Через 7 дней после последней иммунизации у всех животных получали кровь, отделяли сыворотку. После соответствующей обработки сыворотки разводили 1:5 и исследовали на активность специфических противогриппозных антител в РТГА. Сводные данные представлены в Таблице ( графа II). Они свидетельствуют о том, что длительное введение МСМ оказывало иммуносупрессорное действие на формирование специфических антител к вирусу гриппа у животных - 14,2±2,4 ед/мл ( 3-я подгруппа), тогда как введение ИИБЖ и Антивирина- М животным 1-й и 2-й подгрупп способствовало повышению титра антител к вирусу гриппа (61,8±12,2 и 23±4,6 ед/мл,соответственно), что указывало на снижение иммуносупрессии, в сравнении с 4-й контрольной подгруппой. (48±8,3 ед/мл) и 3-й подгруппой, получавшей плацебо. Введение иммунобиологических препаратов стимулировало продукцию антител к вирусу гриппа А/ Aichi, соответственно, во 2-й и 3-й подгруппах животных.

Антитоксическое действие Индуктора интерферона бактериального жидкого и Антивирина М при хронической интоксикации пестицидом МСМ.

Определяли влияние МСМ на показатели кумулятивной смертности животных на модели хронической интоксикации в условиях стимуляции продукции эндогенного α/β-интерферона введением препаратов Индуктора интерферона бактериального жидкого и Антивирина- М. Трем группам мышей (по 20 особей в каждой) вводили МСМ в течение 25 дней в концентрации 0,025 мкг/мл. Одновременно животным 1й и 2-й опытных групп вводили препараты - МСМ и Индуктор интерферона бактериальный жидкий, или МСМ и Антивирин- М по вышеописанной схеме. Контрольная 3-группа животных получала МСМ, без введения препаратов ИИБЖ и Антивирина -М.

По истечении срока моделирования интоксикации (25дней) животным вводили одну летальную дозу вируса ЕМС (1 LD50) после чего в течение 10 дней (срок наблюдения) за животными наблюдали , а также вели учет кумулятивной смертности от действия летального вируса.

Результаты представлены на рисунке. Как видно из представленных данных в контрольной группе мышей (зеленая линия-треугольники) уже с первых суток начался падеж животных. На 10-е сутки погибло 19 животных, в то время как в группе мышей, получившей Антивирин - М (синяя линия- ромбы) через 10 дней пало только 12 животных из 20, а в группе, получавшей ИИБЖ (красная линия- квадраты) за этот же период пало 10 животных из 20. В контрольной группе животных, не получившей препараты ИИБЖ и Антивирин- М, отмечалось двукратное повышение уровня смертности в результате введения летального вируса ЭМК.

Обсуждение

Действие пестицидов нового поколения на системы и органы животных,а также на факторы иммунитета недостаточно изучено. Проводились исследования по изучению устойчивости мышей к действию предельно допустимых доз пестицида глифосата *8 +. Известны работы по изучению действия метсульфурон- метила на организм крыс *4 +. Полученные данные показывают,

что у мышей, подвергавшихся длительному воздействию пестицида МСМ наблюдалась иммуносупрессия, сопровождающаяся интерферонообразования.
иммунобиологических угнетением процесса

Введение таким животным препаратов Индуктора интерферона бактериального жидкого или Антивирина - М способствовало преодолению иммуносупрессии от токсического МСМ. Введение животным препаратов не только защищало организм от токсического влияния МСМ, восстанавливало интерферонпродуцирующую функцию клеток, но и усиливало продукцию интерферона и противогриппозных антител. Повышение продукции интерферона, способствовало защите организма от действия летального вируса, что проявлялось в увеличении сроков выживаемости животных от действия летального вируса более, чем на 50%.

Результаты исследований показывают,что энзимопатическое действие пестицидов способствует угнетению продукции интерферона, снижению активности клеточного иммунитета и сопротивляемости организма к действию летального вируса. Применение противовирусных препаратов- ИИБЖ и Антивирина М стимулирует продукцию интерферона, способствуя преодолению токсического действия пестицидов.

Результаты исследований могут быть использованы для разработки способов применения иммунобиологических препаратов с целью повышения сопротивляемости организма к действию пестицидов.

Список литературы

1. Домшлак М.Г., Макарова-Землянская Е.Н. // Медицина труда и промышленная экология – 2009. - № 1. – С.45- 48.
2. Панина Н.К. Лабораторный контроль за остаточным количеством пестицидов в окружающей среде.// Гигиена и санитария. - 2010. - № 3. – С 77-80.
3. Хамитова Р.Я., Имамов А.А. Медико-экологические аспекты химизации сельского хозяйства. - Казань: Центр инновационных технологий, 2006.-237 с.
4. Лохин К.Б. Гигиеническое обоснование регламентов безопасного применения гербицидов нового поколения на основе пестицида метсульфуронметила: дис. ... канд. мед. - М., 2007. - 32 с.
5. Аширбеков Г.К., Сарсенбаева Ж.К., Ажиханова Г.Ж. Комбинированное действие различных классов пестицидов на организм // Актуальные вопросы формирования здорового образа жизни. - 2009. - №4. – С.175-176
6. Байзолданов Т., Даулетбакова Ф,Д., Байзолданова Ш.Т. Токсикологическое значение пестицидов. //Вестник Казахского Национального медицинского университета. - 2002. - № 2 (16). – С.152-156.
7. Гущин Н.Б., Хайдарова Д.С., Кугушева Л.И. и др. Активность ацетилхолинэстеразы лимфоцитов крыс при интоксикации пестицидам // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1991. – Т. 111, № 2. – С.144 -146.
8. Аспетов Д.Р., Омарова М.Н., Жуматова Б.Х., Кенжебаева А.Т., Шакетова Н.Т. Влияние пестицида глифосата на активность интерферона, индуцированного вирусами гриппа и парагриппа. // Мат.Х∀∣∣ междунар.научн. конф. «Здоровье семьи -XXI век».- г.Лиссабон, Португалия, 27 апреля -06 мая 2013 г. – С. 20 – 23.
9. Ершов Ф.И.Состояние системы интерферона в норме и при патологии.- М.:1996. - С.196-238.
10. Робсон А., Ройт Т.А., Делвз П. Основы клинической иммунологии.: Пер.с англ. - М.: Мир, 2006. – С. 20-171.
11. Dianzani F. The Interferon system. Health Sciences Press. - 1993. – С. 435- 439.
12. Аспетов Р.Д., Белозеров Е.С., Наурузбаева Э.Ч., Пак Н.В., Жуматова Б.Х., Куандыкова С.Ж., Калиева Н.А., Доскожаева С.Т. «Способ лечения больных при вирусных гепатитах» Патент РК № 1686, бюл. № 1, 15.03. 1995. .
13. Калиева Н.А., Жуматова Б.Х., Аспетова Н.А., Пак Н.В., Аспетов Р.Д. Некоторые сведения о препарате Антивирине-М. Сообщение I. Противовирусные свойства Антивирина М // Здравоохранение Казахстана. - 1993. - № 6. – С.17 -19.
14. Ершов Ф.И., Сайиткулов А.М. Микрометод для изучения индукторов интерферона in vitro // Вопросы вирусологии. – 1984. – Том 29. - № 6 –С.756- 757.
15. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М: Медиа-Сфера, 2006. - 312с.