Изучено влияние аллоксана на некоторые показатели углеводного обмена у крыс на фоне предварительной изолированной и комбинированной интоксикации соединениями свинца и хрома в течение 30 суток. У животных определялась концентрация глюкозы, кетоновых тел в крови и моче и уровеньиммунореактивного инсулина в сыворотке крови. Показано, чтокомбинированное действие ацетата свинцаи бихромата калия снижают резистентность бета-клеток поджелудочной железы к диабетогенному действию аллоксана.
Актуальной проблемой современного здравоохранения являетсяпроблема сахарного диабета (СД). Сегодня это заболевание,приобретшее масштабы «Эпидемии неинфекционного характера», - одно из самых изучаемых в медицине[1,2]. Несмотря на выдающиеся исследования в области изучения сахарного диабета и связанных с ним метаболических нарушений, перед диабетологической службой и наукой в целом остается много нерешенных вопросов. Так, не уделяется должного внимания изучению влияний соединений тяжелых металлов на развитие сахарного диабета, между тем известно, чтоорганизм находится под прессом комбинированного действия факторов и зачастую трудно оценить приоритетность той или иной причины в возникновении патологии. Анализ литературы показывает, что исследования лишь констатируют факты выявления диабета у людей, профессионально связанных с соединениями тяжелых металлов, без попыток их комплексного анализа, не рассматриваются также и предпосылки формирования данной патологии [3,4].
В результате целью нашего исследования явилось изучение уровня глюкозы, кетонов в крови, ИРИ у крыс с экспериментальным диабетом на фоне комбинированной свинцовой и хромовой интоксикации.
Материалы и методы
Исследования проведены на 160 беспородных крысах – самцах, массой тела 230-270 г., полученных из вивария Клинико-экспериментальной лаборатории НИИФМ им. Б.А. Атчабарова. Содержание, уход и выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ РК № 697 от 12.11.2009г.). Животные содержались на стандартном рационе вивария, при свободном доступе к воде и пище. Для проведения эксперимента крысы были разделены на следующие группы: 1 группа – интактные животные(вводился физиологический раствор в объеме, эквивалентном объему раствора, вводимого опытным животным); 2 группа – «свинец» (крысы, получавшие ацетат свинца); 3 группа – «хром» (крысы, получавшие бихромат калия); 4 группа - «свинец+хром» (крысы, получавшие комбинацию указанных металлов); 5 группа -«ин+ал», контроль (аллоксановый диабет у интактных крыс); 6 группа - «св+ал»(аллоксановый диабет на фоне свинцовой интоксикации); 7 группа - «хр+ал» (аллоксановый диабет на фоне хромовой интоксикации); 8 группа - «св+хр+ал» (аллоксановый диабет на фоне свинцово-хромовой интоксикации).
Затравку металлами проводили путем ежедневного перорального введения 1% раствора ацетата свинца в дозе 15 мг/кг массы тела и 0,5% раствора бихромата калия в дозе 5 мг/кг массы тела в течение 30 суток. Экспериментальный аллоксановыйдиабет (ЭАД) моделировали путем однократного подкожного введениядиабетогенной дозы 5% раствора аллоксана (Реахим) - 15 мг/100 г массы тела после 48-часового голодания [5,6]. На 3 и 14 сутки после введения аллоксана, измеряли содержание глюкозы и кетоновых тел в крови и мочес использованием глюкометраОрţİит фирмы «MediSense», анализатора мочи DIRUIH-100, реагентных полосок серии URIstikH. Определяли уровень иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сыворотке крови радиоиммунным методом с использованием тест системы рио-ИНС-ПГ-1251 «ХОПИБОХ НАНБ» (Беларусь). Статистическую проводили с StatSoftStatistica
использованием обработку помощью 6.0 и критерия полученных данных пакета программ Biostat, SPSS 16,0с t Стьюдента и нормальности распределения по критерию Шапиро-Уилкса.
Результаты и обсуждение
Изолированная 30-дневная затравка крыс солями свинца и хрома не приводила к гибели животных. Уровень гликемии и ИРИ при свинцовой интоксикации достоверно не изменялся. Между тем,
глюкозы в крови на 35% (р≤0,05), при этом уровень ИРИ имел лишь тенденцию к снижению по сравнению с интактными животными, что, по- видимому, является результатом формирования инсулинорезистентности.
Комбинированное воздействие свинца и хрома в указанный срок приводило к гибели 30% животных ( р≤0,001), снижению уровня ИРИ на 29% (р≤0,05), однако, достоверного увеличения уровня глюкозы крови не отмечалось. В моче экспериментальных животных всех исследуемых групп достоверных отличий содержания глюкозы по сравнению с интактными крысами не было.
Введение аллоксана крысам на фоне изолированной свинцовой и хромовой интоксикации приводило к развитию диабета у 66,6 % и у 72% животных соответственно. Частота развития ЭАД у крыс со свинцово-хромовой интоксикацией при используемой дозе аллоксанасоставила 100% и заметно не отличалась от группы крыс, которым аллоксан вводили на фоне полного здоровья. Таким образом, комбинированное воздействие металлов в отличие от их изолированного влияния усиливает диабетогенное действие аллоксана. Гибель животных в группе «св+хр+ал» была в 2,7 раза (р≤0,05) больше, чем в контроле, в 12 раз (р≤0,001) больше по сравнению с группой животных со свинцовой интоксикацией и в 8,4 (р≤0,001) больше, чем при хромовой интоксикации.
Данные исследования влияния аллоксанана показатели глюкозы и ИРИ в крови у крыс с ЭАД представлены в таблице 1.
введение хрома вызывало увеличение содержания
Таблица 1 - Содержание ИРИ и глюкозы в крови у крыс с ЭАД (М±т)
|
Показатели |
Группы животных |
|||
|
св+хр+ал |
св+ал |
хр+ал |
ин+ ал |
|
|
Глюкоза крови до введения аллоксана (ммоль/л) |
4,6±0,5 |
4,2±0,8 |
4,8±0,3▼ р≤0,05 |
3,5± 0,5 |
|
Глюкоза крови на 3 сутки ЭАД (ммоль/л) |
26,1±0,4▼ р≤0,001 |
16,5±1,5* р≤0,001 |
19,3±1,3* р≤0,001 |
21,8 ±1,4 р≤0, 001 |
|
Глюкоза крови на 14 сутки ЭАД (ммоль/л) |
18±1,5∙ р≤0,001 |
12,2±1,6* р≤0,01 |
15,4±1,2 |
18,1 ±1,2 |
|
ИРИ до введения аллоксана(мкЕД/мл) |
2,2±0,2▼ р≤0,05 |
2,9±0,4 |
2,6±0,2 |
3,1± 0,4 |
|
ИРИ на 3 сутки ЭАД (мкЕД/мл) |
1,08±0,05♦ р≤0,001 |
2,3±0,4* р≤0,001 |
1,7±0,2* р≤0,001 |
1,9± 0,6♦ р≤0, 001 |
|
ИРИ на 14 сутки ЭАД (мкЕД/мл) |
¯¯Ō |
2,7±0,3* |
2,1±0,1* |
1,1± 0,2* |
* - статистически значимые отличия по сравнению с данными группы «св+хр+ал»; ▼ – по сравнению с группой «ин+ал»; •- по сравнению с показателями на третьи сутки ЭАД, ♦ - по сравнению с показателями до введения аллоксана
В ходе экспериментальных исследований установлено, что на третьи сутки после введения аллоксанасодержание глюкозы в крови крыс группы «св+хр+ал», было больше на 20%, чем у животных группы «ин+ал», на 58% больше, чем в группе «св+ал» и на 35% большечем в группе «хр+ал» (р≤0,001 во всех случаях) (таблица 1). По сравнению с соответствующими исходными показателями содержание глюкозы в крови у крыс группы «св+хр+ал» увеличилось в 4,7 раза, в то время как в группе «ин+ал» – в 5,2 раза. В эти же сроки наблюдения средний уровень глюкозы в крови у крыс группы «св+ал» составил 293%, группы «хр+ал» 302% от соответствующих исходных данных (р≤0,001 ко всем показателям). В результате, на третьи сутки развития ЭАД содержание глюкозы в крови в группе «св+хр+ал» было максимальным по сравнению с изолированным воздействием металлов и группой контроля. На 14 сутки ЭАД отмечалось снижение на 31% (р≤0,001) содержания глюкозы в крови у животных группы «св+хр+ал» по сравнению с третьими сутками. В то же время уровень глюкозы у крыс группы «св+хр+ал» был выше на 52% (р≤0,001), чем аналогичный показатель в группе «св+ал». Следовательно, комбинированное действие свинца и хрома привело к развитию более тяжелого (по уровню гликемии) течения ЭАД, по сравнению с группами животных, у которых ЭАД протекал в условиях предварительного изолированного воздействия указанных металлов.
Как видно из таблицы 1, на третьи сутки ЭАД в группе «св+хр+ал» наблюдалось снижение уровня ИРИ на 51% (р≤0,001) по сравнению с данными до введения аллоксана, в то время как в группе «ин+ал» наблюдалась лишь тенденция к снижению. В группе «хр+ал» уровень ИРИ также уменьшился на 35% (р≤0,05), и, напротив, в группе «св+ал» введение аллоксана практически не изменило содержание ИРИ по сравнению с показателями до введения аллоксана. Таким образом, на третьи сутки ЭАД в группе «св+хр+ал» уровень ИРИ был меньше, чем в группах «св+ал» и «хр+ал». На 14 сутки течения диабета уровень ИРИ в сыворотке крови у крыс группы «св+хр+ал» составил 0 мкЕД/мл, в то время как в группе «ин+ал» содержание ИРИ составило 35%
(р≤0,05) от соответствующих данных до введения аллоксана, в группе «св+ал» - 93% (р≤0,001) и в группе «хр+ал» - 81% (р≤0,001). Итак, как на 3, так и на 14 сутки ЭАД на фоне комбинированного воздействия металлов по отношению к их изолированному действию характеризовался минимальным содержанием ИРИ в крови вплоть до нулевых значений на 14 сутки.
Наличие кетоновых тел в крови является одним из основных показателей тяжести течения диабета. При сравнении содержания кетоновых тел в крови в условиях изолированного и совместного действия металлов на третьи сутки ЭАД можно отметить, что введение аллоксана животным на фоне комбинированного влияния свинца и хрома показало более высокий уровень кетоновых тел в крови. Так, при ЭАД на фоне действия свинца уровень кетоновых тел составил 55% (р ≤0,05), а на фоне действия хрома – 61% (р ≤0,05) от такового у крыс группы «св+хр+ал». На 14 сутки течения диабета заметных различий в содержании кетоновых тел в исследуемых группах не было. Следовательно, введение аллоксана в условиях комбинированного действия металлов вызывало более значительное повышение уровня кетоновых тел на 3 сутки по сравнению с их изолированным влиянием.
Таблица 2 - Содержание глюкозы, кетоновых тел в моче у крыс с ЭАД на 14 сутки
|
Группы животных |
ин+ал |
св+ал |
Wilkoxon test (уровень знач.) |
хр+ал |
Wilkoxon test (уровень знач.) |
св+хр+ал |
Wilkox on test (урове нь знач.) |
|
Содержани еглюкозы (ммоль/л) |
17,7(1,22) |
5,24(0,08) |
0,005* z=2,809 |
8,7(0,76) |
0,008* z=2,668 |
25,3(3,6) |
0,012* z=2,810 |
|
Содержани е кетоновых тел (ммоль/л) |
1,49(0,29) |
¯¯0 |
0,004* z=2,871 0,004■ z=2,842 |
0,60(0,1) |
0,044* z=2,010 0,011■ z=2,536 |
2,4(0,33) |
0,026* z=2,232 |
* - статистически значимые отличия по сравнению с данными группы «ин+ал», ■- статистически значимые отличия по сравнению с данными группы «св+хр+ал», М(т) – М среднее, m – ошибка среднего
Интоксикация солями тяжелых металлов животных не вызывала глюкозурию. Введение аллоксана приводило к глюкозурии и кетонурии у крыс всех исследуемых групп. Как видно из таблицы 2, наиболее выраженная глюкозурия и кетонурия отмечалась в 8 группе животных «св+хр+ал». При ЭАД на фоне изолированного воздействия свинца и хрома как глюкозурия (на 70% (Р=0,005) и 50,8% (Р=0,008) соответственно), так и кетонурия ( на 100% Р=0,004 и 75% Р=0,044 соответственно) были менее выражены. Заключение
Полученные данные свидетельствуют о том, что изолированное введение солей свинца и хрома в течение 30 дней не оказывает значительного влияния на уровень ИРИ в крови. При хромовой интоксикации, на наш взгляд, развивается инсулинорезистентность, о чем свидетельствует повышение уровня глюкозы крови при нормальном содержании инсулина.
На фоне изолированной свинцовой и хромовой интоксикации аллоксановый диабет развивается в меньшем проценте случаев, чем у интактных животных, по-видимому, малые дозы металлов способствуют синтезу металлотионеинов, которые повышают резистентность клеток к повреждению за счет снижения ПОЛ, активации гипоксия- индуцибильного фактора HIF [7]. Кроме того, ранее нами было показано [8], что хроническое воздействие малых доз свинца приводит к умеренной активации гипофизарно-надпочечниковой системы, имеющей ключевое значение в повышении резистентности организма к повреждающим факторам. Нельзя исключить, возможную активацию свинцом антиоксидантной системы, имеющей важное значение в защите бета-клеток поджелудочной железы от повреждающего действия аллоксана.В связи с этим повторное воздействие повреждающего фактора (аллоксан) в условиях активации неспецифических механизмов адаптации, вызванных свинцом, характеризовалось относительной сохранностью инкреторной функции поджелудочной железы, чем у животных других экспериментальных групп. Наши данные подтверждаются исследованиями, в результате которых при повторных действиях кратковременных стрессорных ситуаций развивалась адаптация организма, которая не только повышала его устойчивость к тяжелому стрессу, но также обладала широким спектром перекрестных защитных эффектов [9].
Аллоксановый диабет на фоне свинцово-хромовой интоксикации моделируется в большем проценте случаев, протекает тяжелее, о чем свидетельствует более выраженная гипергликемия, глюкозурия, кетонурия, более низкий уровень ИРИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Barnes TL, Crandell JL., Change in DASH diet score and cardiovascular risk factors in youth with type 1 and type 2 diabetes mellitus: The SEARCH for Diabetes in Youth Study/Department of Epidemiology and Biostatistics and Center for Research in Nutrition and Health Disparities, Arnold School of Public Health, University of South Carolina, Columbia, SC, USA 2013. - Vol. 91. - P. 32
- Мкртумян А.М. Материалы конференции «Диабет 2013: проблемы и решения». – М.: 2013. – 60 с.
- Тихонов М.Н. Металлоаллергены: Общая характеристика и оценка неблагоприятного воздействия на здоровье работающих /Экологическая экспертиза. – М.: 2002. - №5. – С. 70-138.
- Гмошинский И.В. с соавт. Влияние биологически активной добавки к пище, содержащей хром, на клиникометаболические показатели у больных сахарным диабетом II типа. / Вопросы питания. – 2004. – №5. – С.17-20.
- Selyatitskaya V.G. Functional State of Adrenocortical System in Rats with Manifest Alloxan-Induced Diabetes Mellitus /
- G. Selyatitskaya, O.P. Cherkasova, T.V. Pankina, N.A. Palchikova /Bull. Exper. Biol. - 2009. - Vol. 146. - P. 708-710.
- Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет: роль в клинической диабетологии. - Л.: Наука, 1983. – 247с. Murphy BJ, Kimura N, Sato BG et al. Metallothionein induction by hypoxia involves cooperative interactions between metal- responsive transcription factor-1 and hypoxia-inducible transcription factor-1 alpha /MolCacer Res. – 2008. – Vol. 6. - N.3. – P. 483-490.
- Ударцева Т.П. Механизмы адаптации к совместному воздействию свинца и ограничения движений. – Алматы: 2001.
- Засухина Г.Д. Адаптивный ответ - общебиологическая закономерность: факты, гипотезы, вопросы. \ Радиационная биология. Радиоэкология. – 2008. – № 4 – Т.48 – С. 464 -473.