Целью исследования было разработать неинвазивную цитологическую диагностику сахарного диабета 2 типа. Материалы и методы включают в себя определение величины индексов дифференцировки и ороговения эпителия выстилающего типа слизистой оболочки полости рта, полученных на основе подсчета ее цитограммы. Способ позволяетпроводить диагностику сахарного диабета 2 типа неинвазивным способом у пожилых.
Актуальность проблемы. Сахарный диабет 2 типа, как возраст-ассоциированное заболевание, по тяжести последствий находится на 3 месте среди заболеваний эндокринной системы[1]. Распространенность диабета в человеческих популяциях составляет в среднем 3-4%. По данным ВОЗ, число заболевших сахарным диабетом к 2025 году достигнет 380 млн., 94% из которых будут страдать сахарным диабетом 2 типа [2]. Для диагностики и мониторинга сахарного диабета 2 типа в основном используются инвазивные методы: определения глюкозы в крови. В литературе недостаточно описаны неинвазивные методы диагностики для больных пожилого возраста.
Целью работы была разработка экспресс- цитологической неинвазивной технологии диагностики сахарного диабета 2-го типа по данным изучения реактивности цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта (СОПР) для пожилых больных.
Материал и методы исследования. В задачи исследования входило: идентификация различных стадий дифференцировки эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта (СОПР) больных сахарным диабетом по данным цитологических, гистохимических и морфометрических исследований, подсчет цитограмм СОПР, определение индексов дифференцировки (ИДиф) и ороговения (ИО) эпителиальных клеток (СОПР) на различных этапах мониторинга заболевания.
Материалом для исследований служили мазки со слизистой оболочки выстилающего, жевательного и специализированного типов от 42 здоровых людей (контрольная группа) и 58 больных сахарным диабетом 2 типа в возрасте от 60 до 73 лет. Для гигиенической оценки состояния слизистой оболочки полости рта использовали гигиенический индекс Грина и Вермильена [3]. При этом отбирались испытуемые с гигиеническим индексом равным 0, что соответствует норме. Все больные были обследованы в РГКП НИИ кардиологии и внутренних болезней МЗ РК (г. Алматы). Диагноз: сахарный диабет 2 типа средней степени тяжести. У исследованных больных диагноз был верифицирован в соответствии с Международными программами и основывался на критериях ВОЗ (1994 г.). Забор материала проводился в 8.00-8.30 утра натощак.
Обследуемая группа людей была однородной по биоритмологическому типу (утренний тип). Мазки забирались на 2-ой день пребывания в больнице, а также на 6 и 12-14 дни после стандартного лечения (метформин,препараты сульфанилмочевины,антиоксидант «Ювелакс»).
После тщательно прополаскивания полости рта физиологическим раствором материал со слизистой оболочки полости рта забирали мягким движением без приложения силы путем соскоба стерильным металлическим шпателем, чтобы в собранную ротовую жидкость попали не насильственно соскобленные, а естественно отделившиеся клетки, переносили его на адгезивные предметные стекла и изготавливали тонкие мазки. Приготовленные мазки высушивали, фиксировали в спирт-ацетоне (1:1) в течение 5 минут и окрашивали метиленовым синим по Май-Грюнвальду (15 мин.) и азур-эозином Романовскому-Гимза (30 мин.). Кроме того, мазки окрашивали по Папаниколау [11].
Для изучения содержания и распределения в цитоплазме РНК препараты окрашивались галлоцианином-хромовыми квасцами, гликогена – ШИК-реакцией, суммарные белки – раствором бромфенолового синего [4].
Для морфометрического исследования использован морфоденситометрический комплекс фирмы Leica: микроскоп DM 1000 (при увеличениях х 200, х 400, х 630 и х 1000), цифровая камера DFC-320 и компьютер (Pentium 4Б 128 M6 ОЗУ, видеокарта 64 Мб, операционная система МicrosoftWindowsXP). С помощью этого комплекса получали изображения эпителиоцитов каждой стадии дифференцировки в формате JPG. Всего цитометрическому и денситометрическому исследованиям подвергнуто 3015 эпителиальных клеток. Затем в клетках определенной стадии дифференцировки цитометрически при помощи программы PhotoM 1.2 (А. Черниговский, 2001) после проведенной калибровки с помощью объект-микрометра определяли площади клеток и их ядер в мкм2 , ядерно-цитоплазматическое отношение – ЯЦО. При денситометрическом исследовании РНК, суммарных белков и гликогена в цитоплазме эпителиоцитов определяли два показателя: среднюю плотность и содержание исследуемого вещества в цитоплазме. На мазках из расчета на 1000 клеток определяли эпителиоциты различных стадий дифференцировки, в том числе дистрофически измененные, с инвазией нейтрофилов микроорганизмами.
мононуклеары с и контаминированные
Кроме того, выявляли цитоплазмой, голоядерные мононуклеары, сегментоядерные нейтрофилы и лимфоциты.
После подсчета цитограмм на мазках со слизистой оболочки полости рта вычисляли индексы дифференцировки (ИДиф) [5] и ороговения (ИО) [6]. ИДиф вычисляют по формуле:
А=1а+2б+3в+4г+5д+6е, где А – индекс дифференцировки эпителиальных клеток в мазках, 1, 2, 3, 4, 5, 6 – цифровые обозначения 1-ой, 2-ой, 3-ей, 4ой, 5-ой и 6-ой стадий дифференцировки эпителиоцитов; а, б, в, г, д, е – процент клеток соответствующей стадии дифференцировки.
ИО – отношение количества ороговевших плоскоэпителиальных клеток к общему числу эпителиальных клеток в процентах. ИОЭК вычисляют по формуле:
ИО= ∑ОЭК/n х 100, где ∑ОЭК – количество эпителиальных клеток, n – общее число эпителиальных клеток.
Анализ полученных данных и оценку достоверности различий средних проводили с использованием критерия Стьюдента с помощью профессионального пакета статистических программ StatSoft (USA) “Statistica – 6”. Изменения показателей считали достоверными при Р < 0,05. При подсчете средних величин ИДиф и ИО СОПР исключены респонденты с местными» и «системными» воспалительными заболеваниями, вирусными заболеваниями и другими эндокринными заболеваниями. Полученные результаты
Для удобства подсчета цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта идентифицировали 6 стадий их дифференцировки по цитологическим, гистохимическим и морфометрическим параметрам ( Таблица 1).
Таким образом, при идентификации эпителиоцитов различных стадий дифференцировки СОПР необходимо учитывать их характерные цитологические, цитохимические и морфоденситометрические особенности. Площадь цитоплазмы минимальная у клеток 1-ой стадии дифференцировки, у клеток 2-ой стадии возрастает и достигает максимальных величин у клеток 3-ей стадии, а затем у клеток 4-ой, 5-ой и 6-ой стадий постепенно снижается. Площадь ядра и ядерно- цитоплазматическое отношение максимальны у клеток 1-ой стадии дифференцировки, а затем постепенно снижается у клеток 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой стадий. Средняя плотность гликогена возрастает от 1-ой до 3-ей стадии, а затем постепенно снижается у клеток 4-ой, 5-ой и была минимальной у эпителиоцитов 6-ой стадии. Количество гликогена нарастает от 1-ой до 3-ей стадии, а затем постепенно снижается к 6-ой стадии. Средняя плотность суммарно белка наибольшая у клеток 1-ой и 2-ой стадий, а у клеток 3-ей, 4-ой, 5ой и 6-ой стадий несущественно колеблется. Количество суммарного белка постепенно возрастает с 1-ой до 3-ей стадии, а у эпителиоцитов 4-ой, 5-ой и 6-ой стадий существенно не отличается.
Результаты проведенных исследований ИДиф и ИО цитограммы мазков со слизистой оболочки полости рта в норме и при сахарном диабете 2 типа на 2-ой, 6ой и 12-14 дни лечения сахароснижающими препаратами позволили расчитать их нижний и верхний пределы для диагностики и мониторинга сахарного диабета 2 типа (таблица 2).
Таблица 1 - Морфоденситометрические показатели эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта на различных стадиях дифференцировки
|
Показатели |
Стадии дифференцировки |
Р |
|||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
||
|
Площадь |
587,4± |
1088,1± |
4104,6± |
2463,6± |
2182,5± |
1323,2± |
Р1,2;2.3;3,4;4,5;5,6< |
|
цитоплазмы, мкм2 |
15,6 |
39,3 |
104,2 |
61,1 |
61,2 |
96,43 |
0,01 |
|
Площадь ядра, |
144,3± |
125,3± |
119,6± |
108,7± |
26,6± |
Р1,2;3,4;4,5 < 0,01 |
|
|
мкм2 |
3,4 |
3,5 |
13,3 |
2,83 |
4,02 |
Р2,3 = 0,1 |
|
|
Ядерно- |
0,25± |
0,12± |
0,03± |
0,043± |
0,012± |
Р1,2;2.3;3,4;4,5;5,6 |
|
|
цитоплазматич еское отношение |
0,07 |
0,04 |
0,005 |
0,0014 |
0,002 |
< 0,01 |
|
|
Средняя оптическая плотность гликогена, усл.ед. |
0,07± 0,003 |
0,082± 0,005 |
0,2±0,01 |
0,14± 0,007 |
0,081± 0,0064 |
0,053± 0,004 |
Р2.3;3,4;4,5;5,6 < 0,01 |
|
Средняя оптическая плотность суммарного белка, усл.ед. |
0,12± 0,009 |
0,1±0,06 |
0,062± 0,0043 |
0,06± 0,0043 |
0,068± 0,004 |
0,058± 0,0043 |
Р1,2;2.3 < 0,01 |
Примечание: Р1,2;2.3;3,4;4,5;5,6 - достоверность различий средних показателей эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта 1-ой и 2-ой, 2-ой и 3-ей, 3-ей и 4-ой, 4-ой и 5-ой, 5-ой и 6-ой стадий дифференцировки.
Таблица 2 – Величины индекса дифференцировки (ИДиф) и индекса ороговения (ИО)цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта в норме и при сахарном диабете 2 типа
|
Контрольная группа |
Группа сахарного диабета 2 типа |
||
|
ИДиф (индекс дифференцировки) |
ИО (индекс ороговения) |
ИДиф (индекс дифференцировки) |
ИО (индекс ороговения) |
|
390,0-450,0 усл. ед. |
0-1,0 усл. ед. |
451,0-525,0 усл. ед. и более |
1,1-30,0 усл. ед. и более |
Таким образом, предложенный неинвазивный позволяет избежать риска инфицирования больных и экспресс-цитологический способ характеризуется как медперсонала, менее трудоемкий и не требует достоверный, отличается простотой мониторинга и значительных экономических затрат.
удобством практического применения. Способ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Балаболкин М.И. Диабетология. - М.: Медицина, 2000. – С. 297-312.
- Старкова Н.Т. Клиническая эндокринология: Руководство. – СПб.: Питер, 2002. – 576 с.
- Боровский Е.В. Терапевтическая стоматология. - М.: 1988. – 560 с.
- Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - М.: «Медицина», 1969. – С. 234-238.
- Быкова И.А., Агаджанян А.А., Банченко Г.В. Цитологическая характеристика отпечатков слизистой оболочки полости рта с применением индекса дифференцировки клеток // Лаб. Дело. – 1987. – № 1. – С. 33 – 35.
- Ергазина М.Ж., Р.И.Юй Предпатент РК на изобретение, № 14227, № госрегистрации 2002/1184.1 от 25.09.2002).13. Yuy R.I. Crevicular Fluids Cytogram Analisis in Patients with Chronic Generalized Parodontitis. International Dental Jounal. – 2012. – Vol. – 12. – P. 206.