Иммунная система и ее генетические ассоциации у детей при комбинированном внешнесредовом воздействии

Изучены особенности специфического иммунного ответа и распределения частот генов эндотелиального фактора роста (VEGF) и цитохрома Р-450 (CYP1A1), копропорфириногеноксидазы (CPOX), транскрипционного фактора р53 и сульфотрансферразы (SULT1A1) у детей в условиях внешнесредового поступления стронция и фенола. Выявлены избыточная распространенность вариантных аллелей генов VEGF, ММР9, SULT1A1, а также их ассоциация с контаминацией биосред стронцием и специфическими IgG к фенолу и стронцию.

Введение. Иммунная система представляет собой исключительно сложную многокомпонентную сеть из быстроделящихся, репопулирующих и покоящихся клеток *2+. Организации с быстрым обновлением элементов более подвержены и более чувствительны к воздействию разнообразных антропогенных факторов *1,3+. В связи с этим, любое токсическое воздействие химического вещества может привести к модификации иммунного ответа, а кумуляция изменений отдельных компартментов иммунной защиты может реализоваться нарушениями структурной целостности и функциональной полноценности иммунной системы в целом *3+. При этом особый интерес вызывают вопросы функциональной организации генома и особенностей генетического полиморфизма протеинов, участвующих в иммунном ответе. Развитие исследований и методического базиса в этом направлении необходимо для профилактического обеспечения путей защиты и стабилизации генома человека в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды *1,2+.

Цель работы – оценка иммунного и иммуногенетического статуса у детского населения в условиях комбинированного внешнесредового воздействия тяжелых металлов и органических загрязнителей (на примере Пермского края).

Группу наблюдения составили 113 обследованных детей в возрасте от 3 до 7 лет, посещающих детские дошкольные учреждения в условиях хронического внешнесредового воздействия комплекса химических соединений, среди которых тяжелые металлы и фенолы, являющиеся репротоксикантами, тератогенами и мутагенами. При этом в группу сравнения включили 57 детей, сопоставимых по полу и возрасту и проживающих на условно чистой территории.

Материалы и методы. Определение органических соединений (мг/л) выполнялось в соответствии с МУК 4.1.2102-4.1.2116-06 на жидкостном и газовом хроматографах.

Содержание металлов идентифицировали методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Фенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» с использованием универсальной программы CellQuestPrO с помощью компьютера Macintosh. Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD25⁺, CD95⁺) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител к мембранным CD- рецепторам («Becton Dickinson», USA), при этом регистрировали суммарно не менее 10 000 событий.

Цитокины (IL17) (пкг/мл) определяли с помощью иммуноферментного анализа (тест-системы фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск) на анализаторе «Elx808IU».

^ецифические к стронцию и фенолу IgG определяли методом модифицированного конкурентного иммуноферментного анализа на анализаторе «Elx808IU» (США) согласно МР 111-14/55-04-02 [3].

Забор материала для ПЦР проводился методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки. Затем проводили выделение ДНК с помощью сорбентного метода, в основе которого лежит разрушение клеток с дальнейшей сорбцией нуклеиновых кислот на сорбент.

Для исследования полиморфных вариантов в изучаемых генах использовали методику ПЦР, в основе которой лежит реакция амплификации и детекция продуктов этой реакции в режиме реального времени с помощью флюоресцентных меток, которыми предварительно помечают используемые для реакции амплификации праймеры. Амплификацию и детекцию осуществляли с помощью термоциклера CFX96, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе.

Для одновременной детекции нескольких продуктов реакции используют разные флюоресцентные метки и зонды (мультиплексная ПЦР). В качестве праймеров использовали участок ДНК генов цитохрома Р-450 CYP1A1 (rs4646421 и rs1048943), копропорфириногеноксидазы CPOX, метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR, матриксных протеиназы MMP9, сульфотрансферразы SULT1A1, белка P53 согласно методическим рекомендациям «Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов» (МР 4.2.0075- 13 от 20.08.2013).

Для определения генотипа человека использовали метод аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиготами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливали по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров. Статистический анализ проведен с использованием пакета программ Microsoft Office и дополнительной программы Statistica 6.0. Достоверность различий между группами считали значимыми при р<0,05.

Обработка данных по генотипированию проводилась с использованием унифицированной программы «Ген Эксперт». Данная программа служит для расчета статистических параметров для исследований "случай- контроль", использующих SNP (диагностику однонуклеотидных полиморфизмов). Использовались статистические методы для описания равновесия частот генотипов и аллелей генов по равновесию Харди- Вайнберга.

Результаты. Химико-аналитическое исследование содержания контаминантов в крови детей группы наблюдения показало превышение относительно группы сравнения в 6,5 раза по мышьяку, в 2,9 раза по стронцию, в 1,78 раза по марганцу и в 1,4 раз по никелю, а также по м-крезолу в 1,54 раз и фенолу в 5,3 раз (p<0,05).

Одновременно установлен достоверно повышенный по сравнению с возрастной нормой уровень специфической сенсибилизации к фенолу и к стронцию. Содержание специфического IgG к фенолу – 0,257±0,064 у.е. при норме <0,13, специфического IgG к стронцию – 0,290±0,071 у.е. при норме <0,10 (p<0,05). Превышение аналогичного показателя в группе сравнения по содержанию специфических антител к стронцию составило в 1,5 раза. При этом у 51,8% детей обследуемой группы регистрировалось увеличение данного показателя относительно уровня физиологической нормы против 20,4% случаев на территории сравнения.

Одновременно на фоне повышенного содержания контаминантов в крови детей наблюдалось угнетение как клеточного, так и гуморального иммунитета. Выявлено подавление фагоцитарной активности относительно показателей возрастной нормы и группы сравнения у 65,8% и 66,7% обследованных соответственно (р<0,05). Аналогично обнаружено уменьшение содержания сывороточного иммуноглобулина А по сравнению с референтным уровнем в 29,8% случаев и контрольными показателями, различия достоверны по критерию кратности превышения (р<0,05). Использование методического приема оценки отношения шансов изменения иммунологических тестов при возрастании концентрации контаминантов в биосредах позволило установить достоверное снижение фагоцитарных показателей при увеличении концентрации марганца, стронция, фенола, хлороформа в крови (R²=0,10-0,45 при p<0,05), а также уменьшение содержания 1ĝА при увеличении концентрации марганца в крови (R²=0,51 при p<0,05). Анализ иммунного статуса детей, проживающих на территории наблюдения, также включал показатели CD- иммунограммы – абсолютное и относительное количество CD3⁺, CD19⁺, CD16⁺56⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD25⁺, С⑉95⁺-лимфоцитов. Выявлено отсутствие достоверных отклонений по сравнению с референтным уровнем, за исключением статистически значимого снижения экспрессии С⑉25-маркера и С⑉95-маркера по процентному содержанию на мембранах иммунокомпетентных клеток (р<0,05). Причем частота регистрации проб ниже референтных значений составила 52,9% и 35,3% по числу CD25⁺- и С⑉95⁺-клеток соответственно. Полученные данные указывают на существование у детей основной группы избыточной или хронической антигенной супрессии, которая затрагивает преимущественно Т-клеточные рецепторы: активационный маркер CD25⁺ и сигнальный апоптотический маркер CD95⁺. Увеличиваются шансы снижения CD4⁺, CD25⁺, CD95⁺ при повышении концентрации марганца и хлороформа в крови (R²=0,29- 0,44 при p<0,05).

Кроме того, исследовали особенности иммунной регуляции и межклеточного взаимодействия. Маркер цитокинового профиля IL-17, находился в пределах референтных значений и примерно в 2,3 раза превосходил уровень в группе сравнения, хотя достоверных различий выявить не удалось. Увеличение концентрации стронция в крови приводит к тому, что увеличиваются шансы повышения уровня IL-17 (R²=0,81, при p<0,05).

Проведена индикация особенностей полиморфизма генов SULT1A1, CYP1A1, MMP9, р53, CPOX, VEGF (таблица 1).

Установлены негативные ассоциации полиморфизма генов детоксикации (CYP1A1, CPOX) характеризующиеся повышенной над группой контроля распространенностью гетерозиготного варианта гена CYP1A1 в 2 раза, а также минорного гомозиготного варианта гена CPOX, при отсутствии патологического аллельного варианта СС в группе контроля (табл. 1). В основной группе в 1,5 раза повышена распространенность минорного аллеля по отношению к группе контроля. Выявленные ассоциации усугубляются тем, что у детей экспонированных стронцием в 1,5 раза повышена частота минорной гомозиготы гена MMP9, а также гетерозиготы гена TP53 (в 1,3 раза), что указывает на наличие негативной генетической вариабельности с предрасположенностью к онкологическим и аутоиммунным заболеваниям.

Для полиморфизма генов пролиферации эндотелия (VEGF) характерно преобладание как минорной гомозиготы (в 1,5 раза), так и гетерозиготного генотипа (в 1,3 раза) по сравнению с группой контроля.

Заключение, выводы. Представленные данные свидетельствуют о негативных генетических ассоциациях воздействия комбинированной шумовой и химической техногенной нагрузки на детей, проявления которой способствуют формированию иммунопролиферативных состояний, патогенетически связанными с преимущественно минорными полиморфизмами генов эндотелиальных факторов.

Применение современных клеточных и молекулярногенетических технологий, в частности ПЦР, послужит основой создания критериев комплексной оценки воздействия химических факторов на адаптацию организма, установления приоритетных маркеров эффекта и чувствительности для идентификации риска и нанесенного вреда здоровью населения.

Таблица 1 – Распределение частот генов SULT1A1, VEGF, CYP1A1, TP53, MMP9, CPOX у детей, потребляющих воду,
содержащую стронций и фенол

Таким образом, у детей, постоянно проживающих в условиях комбинированного техногенного воздействия, были выявлены существенные изменения в иммунной системе с преимущественной супрессией фагоцитарной активности, продукции сывороточных иммуноглобулинов, экспрессии Т-клеточных рецепторов, повышенной специфической сенсибилизации к компонентам факторной нагрузки, на фоне негативной ассоциации с иммуногенетическими нарушениями.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Долгих О.В., Кривцов А.В., Харахорина Р.А., Ланин Д.В. Иммунные и ДНК-маркеры воздействия техногенной нагрузки // Вестник Уральской медицинской академической науки. - М.: 2012. – №4. –– С. 240-241.
2. Предеина Р.А., Долгих О.В., Синицына О.О. Экспериментальное подтверждение экспрессии медиаторов регуляции иммунного ответа в условиях хронической экспозиции фенолами // Здоровье населения и среда обитания, 2013. – №11(248). – С. 30-32.
3. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям: МР 111-14/55-04-02. – М.- Пермь: 2002. – 29 с.
4. Dolgikh O., Zaitseva N., Dianova D., Krivtsov A. Molecular markers of apoptosis in industrial workers // In vivo: international Journal of Experimental and Clinical Pathophysiology and Drub Research: Abstracts of the 4 th international congress of molecular medicine (Istanbul, Turkey, 27-30 June, 2011). – 2011. – Vol. 25. – № 3. – P. 523–524.