Генерация свободных радикалов и процессы пероксидного окисления липидов в слизистой оболочке желудка крыс в условиях сочетанной нитратной и фторидной интоксикации

АННОТАЦИЯ

Исследование проведено на 52 половозрелых крысах линии Вистар в течение 30 дней с целью изучения влияния сочетанной нитратной и фторидной интоксикации на генерацию супероксидного анион- радикала (·〇2_), функционирование ферментативных антиоксидантных систем, интегральный показатель антиоксидантной защиты и показатели пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в слизистой оболочке желудка крыс. Анализ результатов позволил установить синергическое влияние фторидной и нитратной интоксикации на процессы ПОЛ. Влияние на генерацию ·О2_ и антиоксидантные системы имеет более сложное взаимодействие.

Введение. В некоторых регионах Полтавской области существует проблема повышенного содержания фторидов в питьевой воде (Карловский, Машевский, Шишацкий районы) [3]. Схожая ситуация наблюдается в южных районах Республики Казахстан (г. Алматы и некоторые города Акмолинской области) [5]. В связи с повышенным использованием органических и неорганических нитратов в сельском хозяйстве их поступление в организм человека в последние годы также повысилось [6]. Это создает условия, при которых возможно одновременное действие на организм человека двух этих патогенов. Нитрат натрия способен ингибировать избыточную генерацию супероксидного анион-радикала путем угнетения экспрессии индуцибельной NO-синтазы (iNOS, Е.С. 1.14.13.39) [8, 13]. Фторид натрия способен индуцировать выработку супероксида [9-12]. Фтор среди прочего способен ингибировать активность ферментативных антиоксидантных систем организма, тем самым усиливая оксидаци- онный стресс [9, 11]. Также есть данные о том, что избыточное количество нитратов может вызывать усиление пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и снижение ферментативных антиоксидантных систем [8]. Поскольку эти вещества в основном поступают в организм peros (с водой и продуктами питания), то система пищеварения первой испытывает их негативное влияние. Одновременное воздействие двух этих патогенов на слизистую оболочку желудка является недостаточно изученным.

Цель исследования - изучение влияния сочетанной нитратной и фторидной интоксикации на генерацию супероксидного анион-ради- кала (·〇2¯), функционирование ферментативных антиоксидантных систем, интегральный показатель антиоксидантной защиты и показатели ПОЛ в слизистой оболочке желудка крыс.

Материалы и методы. Опыты проведены на 52 половозрелых крысах линии Wistar. Хроническое избыточное поступление нитратов и фторидов и их сочетанное поступление моделировали путем введения нитратов через желудочный зонд из расчета 500 мг/кг, фторидов - из расчета 10 мг/кг. Нитраты и фториды вводили в течение 30 дней. Все манипуляции проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для иссле-

Таблица 1

Генерация супероксидного анион-радикала, состояние процессов ПОЛ и активность антиоксидантных систем в слизистой оболочке желудка крыс, М±т

 

Интактные

Фторидная

Нитратная

Сочетанная

 

животные,

интоксикация

интоксикация,

интоксикация,

 

n=10

10 мг/кг, п=13

500 мг/кг, n=14

п=15

Генерация •Ог¯, нмоль/г■с

Базовая

0,4±0,01

0,61±0,02*

0,82±0,02*"

1,18±0,01*'***#

НАДФН-зависимыеЭТЦ

7,17±0,16

11,4±0,09*

10,0±0,16*"

8,04±0,22*'***/#

НАДН-зависимыеЭТЦ

4,9±0,23

5,32±0,08*

9,4±0,12*"

8,15±0,22*'***/#

НАДФН-оксидаза лейкоцитов

1,33±0,03

2,05±0,02*

1,26±0,03*z**

1,76±0,02*'***/#

Содержание ТБК-реактантов,мкмоль

       

До инкубации

6,1±0,25

17,35±0,44*

8,93±0,2*"

13,65±0,11*'***/#

Послеинкубации

18,2±0,32

32,77±0,59*

25,57±0,24*'**

34,18±1,38*'***/#

Прирост

12,09±0,29

15,42±0,88*

16,64±0,23*

20,53±1,33*'***/#

Активность SOD, у.е.

0,73±0,14

0,26±0,05*

1,16±0,1*'**

0,33±0,02*/#

Активность CAT, нкат/г

204±4

356±32*

145±15*'**

136±10*'***

  • Данные статистически значимо отличаются от интактной группы с p<0,05.

** Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с p<0,05.

*** Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с p<0,05.

  • Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с p<0,05.

довательских и других научных целей». Животные были разделены на 4 группы:

  • первая - интактные животные (n=10);
  • вторая - группа фторидной интоксикации (n=13);
  • третья - группа нитратной интоксикации (п-14);
  • четвертая - группа с сочетанной интоксикацией (n=15).

Продукцию супероксидного анион-радикала (·〇2¯) исследовали модифицированным спектрофотометрическим методом при проведении теста с нитросиним тетразоли ем [2]. Для оценки его генерации НАДФН-зависимы- ми (микросомальными) электронно-транспортными цепями (ЭТЦ) и от NO-синтазы, НАД- Н-зависимым (митохондриальным) ЭТЦ и НАДФН-оксидазы лейкоцитов вводили индукторы в виде НАДН, НАДФН и бактериального липополисахарида (пирогенал). Модификация метода заключалась в том, что при оценке индукции пирогеналом тритон X-IOO вводился после 30-минутной инкубации. Это позволяет сохранить мембраны лейкоцитов неповреждёнными во время инкубации, а после неё облегчает выход ∙O2- из лейкоцитов. Таким образом, точность оценки индукции пирогеналом повышается.

О показателях ПОЛ судили по количеству веществ, образующихся в реакции с тиобарби- туровой кислотой (ТБК-реактантов) [7] и их приростом после инкубации в железо-аскорбатном буферном растворе. Определение активности супероксиддисмутазы (SOD, Е.С.1.15.1.1.) Проводили по определению ингибирования автоокисления адреналина в щелочной среде [4], каталазы (CAT, Е.С. 1.11.1.6.) - по убыванию содержания перекиси водорода в присутствии пробы [1]. Спектрофотометрические исследования проводились на фотоэлектрокалориметре «РМ-2111 Solar» (Беларусь). Результаты подвергались статистическому анализу методом ANOVA, с последующим анализом по Геймсу - Ховелу с поправкой по Данн - Сидаку. Статистическая обработка проводилась с помощью программы MicrosoftExcel и расширения Real Statistic.

Результаты. Изолированная фторидная интоксикация увеличивает базовую генерацию на 52,5 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы (NOS) - на 59 %, митохондриальным ЭТЦ на 8,6 %, от лейкоцитов ткани - на 54,1 %. Нитратная интоксикация показала другую динамику: базовая генерация ∙02- увеличена на 105 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы - на 39,5 %, митохондриальным ЭТЦ - на 91,8 %, от лейкоцитов ткани генерация уменьшилась - на 5,3 %. Хотя нитраты и фториды имеют тенденцию к усилению генерации ·〇2- митохондриальным ЭТЦ, нитраты увеличивают генерацию на 76,69 %, относительно фторидной интоксикации, что объясняется влиянием нитратов на ЭТЦ митохондрий [10]. Генерация ·〇2- микросомальным ЭТЦ и от NOS также имеет тенденцию к увеличению относительно интактной группы, однако фториды на 14 % сильнее индуцируют генерацию ·〇2¯ микросомальным ЭТЦ и от NOS, что связано с активацией ионами фтора различных изоформ NOS [10]. Влияние на НАДФН-оксидазу лейкоцитов носит разнонаправленный характер, что может быть связано с ингибирующим эффектом нитратов на iNOS [10, 13].

Сочетанное избыточное поступление нитратов и фторидов увеличивает базовую генерацию ·〇2- на 93 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы - на 12 %, НАДН митохондриальным ЭТЦ - на 66 %, от лейкоцитов ткани - на 33 %. Таким образом, можно сделать вывод об синергическом эффекте нитратов и фторидов на базовую генерацию ∙O2-. Сочетанное влияние фторидов и нитратов на микросомальные ЭТЦ оказывает выраженный антагонизм этих факторов: снижение генерации ·〇2¯ на 29,47 % относительно фторидной интоксикации и на 19,6 % относительно нитратной.

Активность SOD при изолированной фторидной интоксикации снижается на 64,38 %, CAT повышается на 78,92 %. При нитратной интоксикации SOD повышается на 58,9 %, CAT - сни-

жается на 28,9 2 %. При сочетанной патологии активность SOD снижается на 54,79 %, CAT - снижается на 33,33 %. При сочетанном введении нитратов и фторидов достоверных различий в активности SOD при сравнении с фторидной группой не наблюдается. В ходе анализа активности CAT достоверных различий между нитратной и сочетанной интоксикациями также не обнаружено.

При анализе количества ТБК-реактантов примечательна тенденция к увеличению их содержания до инкубации как при фтористой интоксикации (на 184 %), так и при нитратной (на 46,39 %). Сочетанная интоксикация повышает содержание ТБК-реактантов на 124 %. Прирост ТБК-реактантов при сочетанной интоксикации увеличивается на 33,1 % при сравнении с фторидной, и на 23,38 % - при сравнении с нитратными интоксикациями. Это позволяет сделать заключение о синергетическом угнетающем эффекте нитратной и фторидной интоксикации на не ферментативную антиоксидантную систему.

Выводы

Сочетанная нитратная и фторидная интоксикация оказывает синергетический эффект на базовую генерацию ∙O2- и прирост ТБК-реактантов. Стимулированные генерации от микросомальных и митохондриального ЭТЦ имеют антагонистическую динамику. Ферментативные же антиоксидантные системы показали определенную тропность к ионам фтора (преимущественно CAT) и нитрат-ионам (SOD).

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
  2. Костенко В.О., Цебржинсъкий 0.1. Продукцǐя супероксидного анǐон-радикала та оксиду азоту у тканинİ нирок після хірургічного втручання // Фізіолог. жури. - 2000. - T 46, № 5. - С. 56-62.
  3. Назаренко Е.А., Нікозятъ Ю.Б., ìващенко О.Д. Проблеми забруднення фторидамигрунтів і вод геохİмǐчноï провінцй (на прикладǐ Полтавськоï областǐ) // Екологǐчна безпека. - 2014. - № 1. - С.59-63.
  4. Методи клİнİчних та експериментальних дослǐджень в медицинǐ ⁄ [Л.В.Беркало, О.В.Бобо- вич, Н.О.Боброва та ед.] // пǐд ед. Ī.П.Кайдашев. - Полтава: Полǐмет, 2003. - 96-99 с.
  5. Серикбаева А.К Качество природных вод Республики Казахстан ⁄ А.К.Серикбаева, Л.М.Са- таева, А.М.Азимов // Междунар. науч, ин-т «Educatio». - 2015. - № 2 (9). - С. 21-23.
  6. Смоляр B.I. Нітрати, нǐтрити та нітрозоаміни у харчових продуктах і раціонах ⁄ В.Ī.Смоляр, О.Ì.Циганенко, Г.ТПетрашенко // Проблеми харчування. - 2007. - № 3. - С. 35-44.
  7. Стальная ИД. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - M.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
  8. Bouaziz-Ketata H. Nitrate-induced Biochemical and Histopathological Changes in the Liver of Rats: Ameliorative Effect OfHyparrheniahirta / H-Bouaziz-Ketata, G.B.Salah, H.B.Salah [et al.] // Biomed Environ Sci. - 2014. - Vol. 27 (9). - P. 695-706.
  9. Fina B.L., Lombarte M., Rigalli JP et al. Fluoride increases superoxide production and impairs the respiratory chain in ROS 17/2.8 osteoblastic cells // PLOS ONE. - 2014. - Vol. 9. - Is. 6. - P. 1-6.
  10. Romero-Puertas M.C., Sandalio L.M. Nitric oxide level is self-regulating and also regulates its ROS Partners // Front. Plant. Sci. - 2016. - Vol. 7. - Is. 316. - P. 1-6.
  11. Shivarayaschankara YM., Shivashankara A.R., Bhat PG. et al. Effect of fluoride intoxication on lipid peroxidation and antioxidant systems in rats / Y.M. Shivarayaschankara // Fluoride. - 2001. - Vol. 34. - P. 108-113.
  12. Shushua X., Ziyou L., Ling Y. et al. ARole of Fluoride on Free Radical Generation and Oxidative Stress in BV-2 Microglia Cells // Mediators Imflamm. - 2012. - Vol. 13. - Art. 102954. - P. 1-8.
  13. Yang T., Pelleli M., Zollbrecht C. et al. Inorganic nitrite attenuates NADPH oxidase-derived superoxide generation in activated macrophages via a nitric oxide-dependent mechanism // Free Radic. Biol. Med. - 2015. - Vol. 83. - P. 159-166.
Год: 2016
Город: Алматы
Категория: Медицина