Большинство бактерий способны образовывать прочные биопленки [1]. В составе биопленки бактерии становятся высоко устойчивыми к агрессивным условиям окружающей среды, таких как антибиотики, химическая дезинфекция, иммунные ответы организма [2]. Это вызывает трудность при лечении и определяет необходимость разработки ингибиторов формирования биопленки. В качестве модельного объекта для изучения бациллярных биопленок широко исследуются клетки Bacillus subtilis. Развитие высокотехнологичных направлений медицины значительно расширило лечебное применение различных долгосрочных инвазивных устройств - от сосудистых катетеров до сердечных клапанов, кардиостимуляторов. Staphylococcus aureus являются одними из основных внутрибольничных патогенов, вызывающих инфекции на медицинских имплантатах [3]. Показано, что использования производных фуранонов приводит к ингибированию генов образования биопленок [4]. Нами ранее показано что фуранон Ф105 эффективно подавляет образование биопленок в клетках стафилококков и бацилл.
Цель исследования. Целью работы было идентифицировать молекулярные мишени фуранона Ф105 в клетках бактерий.
Материалы и методы. Для фуранона Ф105 были установлены минимальные подавляющие концентрации (МПК) и минимальные биопленку подавляющие концентрации (МБПК). Минимальную инибирующую концентрацию фуранонов определяли методом микроразведений в среде БМ. Фураноны были разведены средой в 96-луночном пластиковом планшете (Cellstar Grenier bio-one No. 655 180) в концентрациях 0.5-20 мкг/мл. Лунки засевали 200 мл бактериальной культуры (КОЕ 2-9X106) в среде БМ и инкубировали при 37°C. Минимальную ингибирующую концентрацию определяли, как наименьшую концентрацию фуранонов, при которой полностью отсутствовал бактериальный рост на 24 час инкубации. Минимальную концентрацию, ингибирующую образование биопленок, определяли, как наименьшую концентрацию фуранонов, которая полностью подавляла образование биопленок через 72 часа роста (табл. 1).
Для определения клеточных мишеней фуранона Ф105 проводили электрофорез грубого экстракта планктонных и адгезированных клеток бацилл, стафилококков, который показал наличие белков, синтез части которых индуцируется, а части подавляется в присутствии фуранона Ф105.
Таблица 1 - Определение минимальной ингибирующей концентрации у фуранона Ф105
|
МПК |
МБПК |
|
|
Bacillus subtilis |
5 мкг/мл |
10 мкг/мл |
|
Staphylococcus aureus |
0.5 мкг/мл |
2.5 мкг/мл |
|
Micrococcus luteus |
5 мкг/мл |
10 мкг/мл |
|
Staphylococcus epidermidis |
1 мкг/мл |
2.5 мкг/мл |
Результаты и обсуждения. Идентификация белков с помощью MALDI-TOF масс спектрометрии показала, что это в основном ферменты, участвующие в жизненно важных процессах клетки и относящиеся к генам домашнего хозяйства. Учитывая, что содержание ферментов в клетке часто регулируется по принципу обратной связи, можно предположить, что индукция этих белков происходит для восстановления уровня необходимой активности в клетке, ингибированной, по всей видимости, соединением Ф105. Однако не представляется возможным выделить их в четко выраженную группу.
Выводы. Мы предполагаем, что фуранон Ф105 не обладает высокой специфичностью, к какой-либо группе белков, однако воздействует на белки, обладающие ферментативной активностью. Для более точной идентификации возможных клеточных мишеней мы планируем далее проводить их разделение с помощью двумерного электрофореза, а также оценку воздействия фуранона на различные модельные ферменты in vitro.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (Проект №15-1400046)
Список литературы
- Смирнова Т.А. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок/ Т.А.Смирнова, Л.В. Диденко, Р. Р. Азизбекян, Ю. М. Романова // Микробиология. - 2010. - Т.79 - С. 435—446.
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis/ M. B. Edmond, S. E. Wallace, D. K. McClish, M. A. Pfaller., R. N. Jones, R. P. Wenzel // Clinical Infectious Diseases. - 1999. - V.29. - P.239-244.
- Saising, J. Activity of gallidermin on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilm/ L. Dube, A. K. Ziebandt, S. P. Voravuthikunchai, M. Nega, F. Gotz // Antimicrob Agents Chemother.. - 2012. - V. 56 - P.5804-5810.
- Ren, D. Differential Gene Expression To Investigate the Effect of (5Z)-4-Bromo-5-(Bromomethylene)-3- Butyl-2(5H)-Furanone on Bacillus subtilis / D. Ren, L. A. Bedzyk, P. Setlow, D. F. England, S. Kjelleberg, S. M. Thomas, R. W. Ye, T. K. Wood // Applied and environmental microbiology. - 2004. - V.70.- P. 4941-4949.