Возможности фармакологической коррекции экспериментальной доксорубицин-индуцированной иммуносупрессии индуктором эндогенного интерферона амиксином

АННОТАЦИЯ

Цель данного исследования в: изучении роли цитокинзависимых процессов в механизмах формирования доксорубицин-индуцированной иммуносупресии и установить возможность их фармакологической коррекции индуктором эндогенного интерферона амиксином. Исследования проведены на 228 нелинейных мышах. Доксорубициновую иммуносупрессию на животных моделировали в/м введением доксорубицина в дозе 5,0 мг/кг один раз в неделю в течение 4-х недель. Иммунопротекторное действие амиксина оценивали по изменению активности продукции лимфоцитактивирующего фактора перитонеальными макрофагами и чувствительности лимфоцитов периферической крови мышей к комитогенному воздействию ИЛ-1в в условиях in vitro.

Профилактическое применение амиксина уменьшает доксорубицин-индуцированные нарушения секреторной активности перитонеальных макрофагов, восстанавливает функциональный резерв продукции ЛАФ при дополнительной стимуляции макрофагов стафилококками в условиях in vitro и повышает чувствительность лимфоцитов периферической крови к модулирующему воздействию ИЛ- 10 в РБТЛ.

Заключение: доказано иммуномодулирующее действие амиксина при экспериментальной доксорубицин-индуцированной иммуносупрессии

Ключевые слова: экспериментальная доксорубин-индуцированная иммуносупрессия, амиксин, механизмы иммуномодулирующего действия

Введение

Поиск эффективных и безопасных путей снижения иммунотоксического действия противоопухолевых препаратов без ослабления их специфической активности остается актуальной проблемой современной медицины. Большинство схем комбинированного лечения злокачественных новообразований различной локализации содержит противоопухолевый антибиотик доксорубицин, который, наряду с высокой эффективностью и широким спектром противоопухолевого действия, обладает высокой системной токсичностью [1-4]. Учитывая ведущую роль оксидативного стресса в механизмах цито- и имунототоксичного действия доксорубицина [2,5], вполне логичным был поиск средств профилактики иммунотоксических эффектов этого препарата среди иммуномодуляторов с мембранопротекторным и антиоксидантным действием. В этом плане особое внимание привлек индуктор эндогенного интерферона амиксин, который является высокоактивным средством в профилактике и лечении вирусных заболеваний и вторичных иммунодефицитов [6,7]. Однако молекулярные механизмы иммунотропного действия амиксина и возможности его использования с целью коррекции нарушений доксорубицин-индуцированных нарушений иммунитета остаются не выясненными.

Известно, что одним из главных клеточных эффекторов резистентности организма является система мононуклеарных фагоцитов. Как основной источник иммунорегуляторных цитокинов, эти клетки осуществляют взаимодействие неспецифических и специфических факторов резистентности [8]. Способность цитокинов выполнять функцию коммуникационного сигнала между разными популяциями клеток, проникать внутрь клетки, изменяя ее метаболизм, осуществлять дистанционное воздействие на ЦНС, открывает реальную перспективу расширения представлений о механизмах компенсаторных реакций [9].

Широкий спектр регуляторных эффектов цитокинов, их реальное влияние на резистентность организма и чрезвычайная чувствительность их эндогенной секреции влиянию всевозможных негативных факторов может служить основанием для использования динамики их продукции в качестве интегральной оценки функционального состояния организма. Классической моделью мононуклеарных фагоцитов является перитонеальные макрофаги. Известно, что лимфоцитактивирующая активность (ЛАФ-активность) перитонеальных макрофагов отражает общую продукцию провоспалительных цитокинов этими клетками, прежде всего интерлейкина-1, интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей [10]. С другой стороны, процесс регуляции иммунных функций зависит не только от интенсивности продукции цитокинов, но и от чувствительности клеток - мишеней к их модулирующему воздействию [8,9].

Поэтому, принимая во внимание то, что наиболее важной составной частью лимфоцитактивирующего фактора (ЛАФ) является ИЛ-1, нами одновременно исследовалась чувствительность лимфоцитов периферической крови животных к комитогенному влиянию ИЛ - 1в в реакции бласттрансформации. Характер нарушений секреторной активности мононуклерних фагоцитов и чувствительности лимфоцитов к комитогенному воздействию цитокинов как в условиях формирования доксорубицин - индуцированной иммуносупрессии, так и профилактического применения амиксина остаётся не выясненным.

Целью исследований было выяснение участия цитокинзалежних процессов в механизмах формирования доксорубицин-индуцированной иммуносупрессии и определения возможностей их фармакологической коррекции индуктором эндогенного интерферона амиксином.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования выполнены на 228 нелинейных мышах массой 18-22 г, выращенных в питомнике вивария Одесского национального медицинского университета на стандартном рационе согласно санитарно - гигиеническими нормами и требованиями GLP. Все манипуляции на животных проводили согласно требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Доксорубициновую иммуносупрессию на животных моделировали в/м введением доксорубицина в дозе 5,0 мг/кг один раз в неделю в течение 4-х недель [11]. Амиксин-IC («ИнтерХим», Украина) вводили профилактически в течение всего периода воспроизведения доксорубициновой иммуносупрессии в/брюшинно в дозе 2,0 мг/кг. Контрольная группа животных получала соответственно по 0,5 мл воды для инъекций.

Выделение макрофагов с перитонеальной полости декапитированных животных проводили путём их смыва 5 мл среды 199 («Sigma-Aldrich», Германия ) с добавлением 100 ЕД/мл бензилпенициллина натрия («Киевмедпрепарат», Украина). Выделенные перитонеальные макрофаги суспендировали в среде 199 в концентрации 3 млн. клеток/мл и размещали в 24-луночную плату по 2 мл в каждую лунку для культивации (Scientific flow laboratories, UK). Для индукции образования лимфоцитактивирующего фактора ( ЛАФ ) использовали Staphylococcus aureus (Р-209) в расчете 2030 убитых нагреванием микробных тел на 1 фагоцит. Активированные in vitro и неактивированные мононуклеарные фагоциты инкубировали в течение 2 часов при 37°С в атмосфере 7 % углекислого газа (СО2 - инкубатор, Flow laboratories, UK), удаляли супернатант с неприлипшими клетками и добавляли в том же количестве среду 199 с 5% сывороткой крупного рогатого скота, 100 Ед/мл бензилпенициллина натрия и 2 мМ глутамина.

Суспензию клеток инкубировали еще в течение 18 часов в тех же условиях и удаляли центрифугированием (1500 g при 400 ° С в течение 30 мин). До измерения активности ЛАФ супернатант держали при -20°С. ЛАФ-активность инкубатов мононуклеарных фагоцитов оценивалась по их способности вызывать комитогенное влияние на пролиферацию тимоцитов, стимулированных субоптимальными дозами лектинов [12]. Культивацию клеток проводили в 96 - луночных планшетах (Flow laboratories, UK). В каждую лунку вносили 100 мкл суспензии тимоцитов (0,5 млн. клеток), 50 мкл Con A (0,25 мкг ) и 50 мкл исследуемых образцов супернатантов в различных разведениях (1:16, 1:32). Контролем были культуры без супернатантов и культуры с препаратом ИЛ-1в (бателайкин) в оптимальной стимулирующей концентрации (250 нг/мл). Каждую опытную и контрольную пробы ставили в 3-4 параллельные лунки.

Планшеты помещали в СО2-инкубаторе с 5% газа при температуре 37°С и 100 % влажности. Через 56 часов в культуру вносили меченый тритием тимидин в расчете 5 мкКИ/мл ("Изотоп", РФ). Через 16 часов после окончания культивации клетки переносили на фильтры с помощью полуавтоматического харвестера. Включение меченого тимидина в ДНК разделенных клеток оценивали с помощью сцинтилляционного в—счетчика (LKB). За единицу активности лимфоцитактивирующего фактора принимали такую его концентрацию (в мл), которая усиливала пролиферацию тимоцитов на 50 % относительно её максимальной стимуляции, вызываемой субоптимальной дозой лектина в предложенной тест-системе.

Лимфоциты периферической крови выделяли общепринятым методом. Для осуществления реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) периферической крови клетки культивировали in vitro с Con A (0,75 мкг / мл ) и препаратом беталейкин («ГосНИИ ОЧБ ФГУП», РФ) в дозе 0,06 мкг/мл. Включение меченого Н3-тимидина оценивали с помощью сцинтилляционного в - счетчика (LKB). Реакцию оценивали количественно по включению метки в ДНК лимфоцитов в течение 1 минуты [13]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью критерия Стьюдента [14] .

Результаты и обсуждение. Проведенные исследования показали, что перитонеальные макрофаги интактных мышей ЛАФ-активностью не обладают, в то время как стимуляция макрофагов стафилококками в условиях in vitro приводит к инициации продукции цитокинов этими клетками.

Установлено, что курсовое введение доксорубицина сопровождается выраженными изменениями продукции ЛАФ, характер которых зависит от длительности применения цитостатика. В частности одноразовое введение доксорубицина не вызывало спонтанной продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами животных, тогда как их стимуляция с помощью Staphylococcus aureus в условиях in vitro инициировала продукцию ЛАФ, но не выявила достоверного увеличения этого показателя по сравнению с стимулированными макрофагами интактных животных.

Двукратное введение доксорубицина инициировало продукцию ЛАФ макрофагами, которая регистрировалась в течение 48 часов, в то время как стимуляция этих клеток дополнительно увеличивала продукцию цитокинов во все сроки наблюдений, но по своей интенсивности не превышала стимулированную продукцию макрофагов у интактных животных.

Как известно, ЛАФ-активность супернатантов макрофагов отражает продукцию ряда цитокинов этими клетками, а именно: ИЛ-1, ИЛ-6, (TNF) - фактора некроза опухолей, и, таким образом, является прямым доказательством активного синтеза иммунорегуляторных пептидов в ответ на воздействие экзогенных факторов. Вероятно, что повторное введение доксорубицина, вследствие инициации оксидативного стресса, может изменять метаболизм макрофагов и побудить их к секреции цитокинов [2,5] .

Таблица 1 - Влияние курсового введения доксорубицина (5,0 мг/кг, в/м) на динамику

продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей без и после дополнительной стимуляции Staphylococcus aureus в условиях in vitro (ЛАФ-активность x 10-3 ед/мл) (М ±m) (n = 8)

Примечание: * - изменения достоверны по сравнению с интактной группой, (Р < 0,05).

Трехразовое, с недельным интервалом, введение доксорубицина также приводит к активации перитонеальных макрофагов и вызывает еще более длительную (свыше 72 часов) продукцию ЛАФ. Но уровень этой продукции был достоверно ниже, чем у животных предыдущей группы. После 3разового введения цитостатика перитонеальные макрофаги подопытных животных практически не отвечали повышением продукции ЛАФ в ответ на дополнительную стимуляцию клеток стафилококками в условиях in vitro. При этом стимулированная продукция ЛАФ была более чем в два раза меньшей, чем соответствующий показатель у интактных животных. Наиболее характерным признаком трёхразового применения доксорубицина был тот факт, что стимуляция макрофагов уже не способствовала дополнительному увеличению их ЛАФ - активности.

Однако, наиболее выраженные изменения секреторной активности макрофагов были зафиксированы после 4-разового введения доксорубицина (табл..1).

Продукция ЛАФ перитонеальными макрофагами животных этой группы была еще менее интенсивной, но по сравнению с другими периодами применения цитостатика, более длительной, и сохранялась свыше 72 часов. Учитывая известные литературные данные, свидетельствующие о негативном влиянии длительной продукции цитокинов на функцию иммунокомпетентных клеток [9], этот факт можно рассматривать как один из вероятных механизмов развития иммуносупрессии, которая имеет место в условиях длительного применения доксорубицина.

Наиболее характерным признаком доксорубицин-индуцированной иммуносупрессии было снижение стимулированной продукции ЛАФ до уровня даже ниже, чем спонтанная продукция цитокинов. Если без стимуляции активность продукции ЛАФ макрофагами животных этой группы составила 2,2 ± 0,3 (х10-3 ед/мл ), то после дополнительного воздействия стафилококков она снижалась до уровня 1,4 ± 0,2 (х 10-3 ед/мл) (Р < 0,05). Это означает, что при данных условиях эксперимента дополнительная стимуляция макрофагов вызывает противоположный эффект и, наоборот, подавляет продукцию ими ЛАФ. Снижение реакции макрофагов в ответ на воздействие микробных агентов может рассматриваться нами как один из вероятных патогенетических механизмов развития инфекционных осложнений в условиях длительной химиотерапии доксорубицином.

Известно, что лимфоциты периферической крови животных отвечают реакцией бласттрансформации на воздействие ИЛ-1в в присутствии субоптимальной дозы лектинов - в этом проявляется хорошо известный комитогенний эффект ИЛ-1 в [15,16]. В наших экспериментах в условиях in vitro препарат ИЛ-1в - беталейкин вызывал такое действие в дозе 0,06 мкг/мл в присутствии субоптимальной (0,625 мкг/мл ) дозы Con A. Нами установлено, что индуцированное ИЛ-1в включение Н3-тимидина в ДНК лимфоцитов периферической крови интактных животных увеличивалось в 8,42 раза, о чем свидетельствовало увеличение зарегистрированных импульсов с 788 ± 59 до 6639 ± 310 (Р < 0,05).

Таблица 2 - Влияние амиксина на продукцию ЛАФ (Х10-3 ед/мл) перитонеальными

макрофагами и чувствительность лимфоцитов периферической крови к комитогенному влиянию ИЛ-1в in vitro (импульсов в минуту) у животных на фоне экспериментальной доксорубициновой иммуносупрессии, индуцированной 4-разовым введеним доксорубицина 1 раз в неделю в дозе 5,0 мг/кг, в/м) (n= 8 -10) (M±m)

Примечание: 1. * - (Р < 0,05) по сравнению с животными контрольной группы;

2. # - (Р < 0,05) по сравнению с интактными животными

Курсовое 4-разовое введение доксорубицина приводило практически к полной утрате ответной реакции лимфоцитов на комитогенное воздействие ИЛ-1в. Показатель, характеризующий интенсивность РБТЛ при этом снижался с 6639 ± 310 до 628 ± 49 имп/мин, что в 10,6 раз меньше, по сравнению с аналогичным у интактных животных. Достоверно уменьшалась на 49,2 % - с 788 ± 59 до 400 ± 30 имп/мин (Р < 0,05) и митотическая активность лимфоцитов в условиях их культивации только с Con А без присутствия ИЛ-1в. Таким образом, лимфоциты периферической крови животных в условиях доксорубицин-индуцированной иммуносупрессии теряли чувствительность к ИЛ-1в и переставали отвечать пролиферацией в ответ на его комитогенное влияние. Уменьшение интенсивности бласттрансформации лимфоцитов наблюдалось в течение всего срока наблюдения ( 072 часов).

Таким образом, нами установлено, что модель доксорубициновой иммуносупрессии приводит к снижению продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами, и, что особенно важно, характеризуется снижением функционального резерва продукции ЛАФ макрофагами при их дополнительной стимуляции стафилококками, а также резким угнетением пролиферативной активности лимфоцитов в РБТЛ в ответ на комитогенний влияние ИЛ-1в .

Профилактическое применение амиксина существенно меняло показатели резистентности организма. На фоне иммуномодулирующей терапии перитонеальные макрофаги животных сразу же после окончания курсового введения доксорубицина секретировали ЛАФ гораздо интенсивнее, чем без коррекции, но продолжительность этой секреции сокращалось до 48 часов, тогда как в условиях доксорубициновой иммуносупрессии без коррекции этот срок превышал 72 часа (табл.2).

Учитывая, что избыточная и продолжительная продукция цитокинов может вызвать повреждающее влияние на некоторые показатели резистентности организма, зафиксированные нами ограничения длительной продукции ЛАФ может расцениваться как одно из проявлений имунопротекторного действия амиксина.

При этом иммунокоррекция способствовала активному восстановлению функционального резерва продукции ЛАФ макрофагами в условиях их дополнительной стимуляции стафилококком. Если в условиях доксорубициновой иммуносупрессии стимулированная in vitro продукция ЛАФ макрофагами нелеченных животных составила 1,4 ± 0,2 («10-3 ед/мл), то при профилактическом применении амиксина она увеличивалась до 6,6 ± 0,4 («10-3 ед/мл ) (Р < 0,05). Иммунокоррекция амиксином увеличивала резерв стимуляции секреторной активности макрофагов (соотношение стимулированной и нестимулированный продукции ЛАФ) в периоде наблюдения 0 часов - в 1,38 раза (Р < 0,05 ), через 24 часа - в 1,47 раза (Р < 0,05), через 48 часов - в 10,0 раз (Р < 0,05).

Это указывает на способность амиксина восстанавливать утраченную в условиях химиотерапии доксорубицином способность макрофагов отвечать на действие микробных агентов активным синтезом иммунорегуляторных пептидов, обеспечивая участие этих клеток в реализации противоинфекционной иммунитета организма.

Вместе с тем известно, что эффективность модуляции иммунного ответа зависит не только от интенсивности продукции имуномедиаторов, но и от чувствительности клеток-мишеней к их регулирующему воздействию. В частности нами установлено, что лимфоциты периферической крови в условиях иммунокоррекции доксорубицин-индуцированной иммуносупрессии, в отличие от животных нелечённой группы, сохраняли способность к бласттрансформации в присутствии Con A фактически на уровне показателей интактной группы и отвечали значительным усилением РБТЛ в ответ на дополнительное комитогенное влияние ИЛ-1в. Если комитогенний влияние ИЛ-1в на пролиферацию лимфоцитов у животных контрольной группы (без иммунокоррекции) в сроке наблюдения 0 часов проявляло себя увеличением количества радиоактивных импульсов с 400 ± 30 до 628 ± 49 имп/мин (Р < 0,05), то на фоне профилактического применения амиксина этот показатель увеличивался с 660 ± 47 до 4551 ± 240 имп/мин (Р < 0,05). Подобный характер активирующего влияния амиксина на показатели

стимулированной in vitro бласттрансформации лимфоцитов наблюдался и в другие сроки наблюдения (24 - 72 часа) после последнего введения доксорубицина.

ВЫВОДЫ:

1. Курсовое введение доксорубицина сопровождается угнетением имуносекреторной активности перитонеальных макрофагов и интенсивности бласттрансформации лимфоцитов вследствие потери их чувствительности к комитогенному влиянию ИЛ - 1в в условиях in vitro .

2. Профилактическое применение индуктора эндогенного интерферона амиксина уменьшает доксорубицин-индуцированные изменения цитокинпродуцирующей активности перитонеальных макрофагов, восстанавливает функциональный резерв продукции ЛАФ в условиях дополнительной стимуляции макрофагов стафилококками в условиях in vitro и повышает чувствительность лимфоцитов периферической крови к модулирующему влиянию ИЛ - 1в в РБТЛ .

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Индуцированная антрациклинами кардиотоксичность: механизмы развития и клинические проявления / М.Г.Матяш, Т.Л.Кравчук, В.В.Высоцкая и др.// Сибирский онкол. журнал. - 2008. - №6(30). - С.66-76.
2. Anthracycline-induced cardiotoxicity: overview of studies examining the roles of oxidative stress and free cellular iron / T. Simunek, M. Sterba, O. Popelova et al. // Pharmacol. Rep. - 2009. - Vol.61,№1. - P.154-171.
3. Doxorubicin acts via mitochondrial ROS to stimulate catabolism in C2C12 myotubes / L. A. Gilliam, J. S. Moylan, E. W. Patterson et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. - 2012. - Vol. 302, №1. - P.195-202.
4. Клиническое значение кардиотоксичности антрациклинов: современные подходы к диагностике, профилактике и лечению / Фандеев О.А., Васечкин С.С., Алехин М.Н. и др. // Кардиология. - 2011. - №7. - С.40-47.
5. Саенко Ю. В. Изучение органоспецифических механизмов оксидативного стресса: дис... на соиск. учён. степен. канд. биол. наук: 14.00.25 - фармакология / Ю.В.Саенко. - Ульяновск, 2006. - 168 с.
6. Вивчення впливу інтерфероногену «Аміксин-ІС» на інтерфероногенез і цитотоксичну активність NK- клітин у хворих на хронічний гепатит С / С.В.Нікітін, К.Л.Сервецький, К.М.Усиченко, О.О.Буйко // Досягнення біологіі та медицини. - 2008. - №2(12). - С.4-8.
7. Synthetic and natural immunomodulators acting as interferon inducers / D.S. Silin, O.V. Lyubomska, F.I. Ershov et al. // Current Pharmaceutical Design.- 2009. - Vol.15. - P.1238-1247.
8. Innate immunity in aging: impact on macrophage function / J. Plowden, M. Renshaw-Hoelscher, C. Engleman et al. // Aging Cell. - 2004. - Vol.3, №4. - P.161-167.
9. Кетлинский С. А. Цитокины / С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев.- С-Пб.: Фолиант, 2008. - 552 с.
10. Ковальчук Л.В. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии: учебник / Л.В.Ковальчук. Л.В.Ганковская, Р.Я.Мешкова. - М.: ГЭОТАР-МЕДИА,2011. - 640 с.
11. Ефективність застосування тіотриазоліну за умов доксорубіциновоі кардіоміопатіі / І.С.Чекман, Т.С.Трофімова, І.А.Мазур, Н.О.Горчакова// Запорожский медицинский журнал. - 2010. - Т.12,№5. - С.207210.
12. Rosenwasser L. J. Ability of human leukocytic pyrogen to chance phytohemagglutinin induced murine thymocyte proliferation / L.J.Rosenwasser, C.A. Dinarello // Cell. Immunol. - 1981. - V. 63, № 1. - P. 134 - 142.
13. Гончаров А.Г. Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса: практикум / А. Г. Гончаров, И. С. Фрейдлин, В. С. Смирнов - Калининград: Изд-во КГУ, 1997. - 73 с.
14. Лапач С. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exel / С. Н. Лапач, А. В. Чубенко, П. Н. Бабич - К.: Морион, 2001. - 320 с.
15. Hedger M. P. Divergent cell-specific effects of activin-A on thymocyte proliferation stimulated by phytohemagglutinin, and interleukin 1 beta or interleukin 6 in vitro / M. P. Hedger, D. J. Phillips, D. M. Kretser // Cytokine. - 2000. - Vol. 12, № 6. - P. 595 - 602.
16. Олейник А. А. Рецепторы и механизмы реализации нейротропных эффектов цитокинов и факторов роста / А. А. Олейник, Р. С. Вастьянов // Успехи физиол. наук. - 2008. - т.39, № 2. - С. 47 - 57.