Получение производных уксусной кислоты и их биологическая активность

Синтезировано два производных уксусной кислоты - пара-хлорацетилфенилуксусная кислота и пара-хлорфеноксиуксусная кислота, путем взаимодействия фенилуксусной кислоты и хлорацетил хлорида в растворе хлороформа в присутствии катализатора FeCl₃ и реакции кипячения в воде n- хлорфенола с натриевой солью монохлоруксусной кислоты, соответственно. Пара- хлорацетилфенилуксусная кислота и пара-хлорфеноксиуксусная кислота обладают избирательной противоопухолевой активностью, в частности ингибируют рост клеток рака гортани и при этом совсем не токсично или слабо ингибируют рост клеток рака шейки матки, клеток T лимфобластной лейкемии, клеток меланомы мыши и нормальных клеток организма, в частности фибробластов, что очень важно при химиотерапии опухолевых заболеваний.

Ключевые слова: пара-хлорацетилфенилуксусная кислота, пара-хлорфеноксиуксусная кислота, цитотоксичность.

Экспериментальная и клиническая онкология располагает широким спектром канцеролитиков и противоопухолевых препаратов для лечения рака. Но, несмотря на это, поиск новых противоопухолевых препаратов продолжается, так как большинство препаратов высоко токсичны для здоровых клеток организма (например LD₅₀ для цисплатина и карбоплатина составляет соответственно 12,5 и 36 мг/кг) [1]. Поэтому в настоящее время одной из наиболее перспективных разработок в этой области можно считать исследования по созданию новых противоопухолевых препаратов с высокой избирательностью действия в отношении раковых клеток и низкой токсичностью для нормальных клеток организма.

Цель исследования - синтез производных фенил- и феноксиуксусной кислот, и изучение их биологической активности, в частности на цитотоксичность на культурах клеток, как раковых, так и здоровых нетрансформированных клеток.

Материалы и методы

Синтез производных уксусной кислоты.

В круглодонной колбе, снабженной обратным холодильником и стеклянной трубкой для выделения хлористого водорода, растворяют 13,6 г (0,1 моль) фенилуксусную кислоту в 50 мл хлороформа, 0,1625 г (0,001 моль) безводного FeCI₃ и добавляют 11,3 г хлорацетилхлорида. Нагревают 7 часов при температуре кипения хлороформа. После окончания выделения хлористого водорода, хлороформ перегоняют и реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и промывают раствором соды. Водный раствор подкисляют разбавленной соляной кислотой. После перекристаллизации из горячей воды выход пара-хлорацетилфенилуксусная кислота составляет 19,2 г; т.пл. 94°С. Пара-хлорфеноксиуксусную кислоту получали реакцией кипячения в воде п- хлорфенола с натриевой солью монохлоруксусной кислоты, в течении 3 часов с последующим подкислением соляной кислотой.

Исследование биологической активности.

ПКФ получали из дермы крыс, культивировали в среде DMEM/F-12 (Invitrogen, UK) 10% FBS фетальной сыворотки теленка (SIGMA, USA) и 1 % раствора антибиотика-антимикотика (SIGMA, USA) при 37°С, 5% С0₂ [2]. Культуры раковых клеток культивировали в среде RPMI- 1640 (SIGMA, USA) с антибиотиком, L-глутамином, 10% FBS (SIGMA, USA) в С0₂-инкубаторе (SHEL LAB, USA). Клетки снимали 0,25% трипсином и 0,02% раствора Версена (1:3). Скрининг веществ на цитотоксичность проводили методами МТТ-теста [3] и ЛДН-теста, используя кит LDH-Cytotoxicity Assay Kit (BioVision, USA).

Результаты и обсуждение

Синтез пара-хлорацетилфенилуксусной кислоты, предлагаемый нами, происходит в присутствие малых количеств хлористого железа. Метод характеризуется малым расходом катализатора и легким выделением продукта реакции. Хлорацетилирование фенилуксусной кислоты протекает очень легко в присутствии хлористого железа в качестве катализатора в растворе хлороформа и выход продукт реакции доходит до 90-91%. Пара-хлорацетилфенилуксусная кислота - белое кристаллическое вещество с характерным запахом, C_ioH₉O₃CI, 212,5 кДа, т.п. 49⁰С (из воды), растворяется в спирте, воде и эфире. Пара-хлорфеноксиуксусная кислота - белое кристаллическое вещество с характерным запахом, т.п. 78⁰С, растворяется в спирте, воде, бензоле и эфире.

Таблица 1 - Цитотоксическая активность производных феноски- и фенилуксусной кислот на раковых и нормальных клетках (процент ингибирования клеток) (MTT-assay).

Процент подавления клеток, %

Примечание: достоверное отличие от контроля Р<0,05

Для определения цитотоксичности полученных веществ были использованы верифицированные культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa), гортани (НЕр-2), рака молочных желез (HBL-100) и T лимфобластной лейкемии (CCRF-CEM), полученные из банка клеточных культур Института цитологии РАН, а также культура здоровых клеток кожи - первичная культура фибробластов (ПКФ) и культура клеток меланомы мыши (КМЛ), полученные в институте биоорганической химии АН РУз. Тестирование проводили трижды по каждому методу, веществу и концентрации, затем проводили анализ и статистическую обработку полученных данных. В качестве препарата сравнения использовали противоопухолевый препарат - «Cisplatin» (Индия). В качестве контроля служили интактные клетки, в которые вносили только среды культивирования.

Как видно из таблицы 1, производные фенилуксусной кислоты в сравнении с противоопухолевым препаратом «Cisplatin» показали избирательную активность, ингибировали рост клеток рака гортани и не подавляли рост гормонозависимых клеток рака шейки матки.

Известно, что ряд производных фенилуксусной кислоты ингибируют циклооксигеназу-1 и 2. Поэтому они являются особенно подходящими для лечения зависящих от циклооксигеназы-2 нарушений, включая воспаления, болей различной этиологии, рака (например, колоректального рака) и др.[4]. В связи с этими данными наши исследования подтверждают, что производные фенил- и феноксиуксусной кислоты из исследованных культур клеток ингибируют больше всего клетки рака гортани и обладают низкой цитотоксичностью для здоровых клеток организма.

На культурах клеток рака молочных желез HBL-100 смотрели появление в среде инкубации цитозольного фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ), который является маркером нарушения целостности клеточной мембраны (табл. 2)

Таблица 2 - Ингибирование клеток рака молочной железы (LDH-assay)

Как видно из таблицы 2 утечка ЛДГ, свидетельствующая о нарушении целостности мембран, наблюдается только после воздействия на клетки рака молочной железы производных уксусной кислоты в низких концентрациях 10-1 мкг/мл и особенно пара-хлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации 1 мкг/мл.

Скрининг на цитотоксичность пара-хлорацетилфенилуксусной и пара-хлорфеноксиуксусной кислот проводили и на культурах клеток рака меланомы мыши (КМЛ) и клеток рака T лимфобластной лейкемии (CCRF-CEM) (табл. 3)

Таблица 3 - Ингибирование клеток рака меланомы мыши-КМЛ и T лимфобластной

лейкемии - CCRF-CEM (MTT-assay) в процентах

Как видно из таблицы 3, подавление роста клеток T лимфобластной лейкемии наблюдается только при воздействии на них пара-хлорацетилфенилуксусной кислоты в высокой концентрации 100 мкг/мл, а на рост клеток меланомы мыши в исследуемых концентрациях ингибирующей активности не наблюдалось.

Выводы

Таким образом, полученные соединения биологически активны, обладают селективной цитотоксичностью в низких концентрациях (1-10 мкг/мл), ингибируют рост клеток рака гортани, слабо ингибируя при этом рост ряда других раковых клеток и нормальных клеток, что очень важно при создании противоопухолевого препарата. Выявлено увеличение нарушения целостности мембран клеток рака молочных желез при воздействии данных соединений в очень низких концентрациях - 1 мкг/мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Wang KR, Zhang BZ, Zhang W, Yan JX, Li J, Wang R. Antitumor effects, cell selectivity and structure-activity relationship of a novel antimicrobial peptide polybia-MPI//Peptides - 2008.-№ 29(6).-С. 963-968.
2. Meske V., Albert F., Ohm T.G..// J. Neural Transm.- 1999 - №106. С. 537-548.
3. Mosmann Т.// J. Immunological Methods. USA.- 1983 - Vol. № 65. -С. 69.
4. Федоров Б.С., Фадеев М.А., Козуб Г.И., Алиев З.Г., Алдошин С.М., Коновалова Н.П., Сашенкова Т.Е., Блохина С.П..// Химико-терапевтический журнал - 2009-Т.13 № 3. -С. 6-12