Введение. С иммунобиологических позиций состояние здоровья современного человека и человечества в целом характеризуется снижением иммунологической реактивности, повышением острой и хронической заболеваемости. Результатом этого является большой интерес врачей практически всех специальностей к проблеме иммунотерапии, которая характеризуется как относительно новое направление в медицине(1-2). В связи с этим проблемы предупреждения и восстановления иммунологических нарушений с помощью иммуномодулирующих препаратов в настоящее время не требует обоснования(3). Растительные адаптогены относят к препаратам экстраиммунного (экзогенного) воздействия и используют как комплекс неспецифических средств, направленных на улучшение общего состояния организма обмена веществ, так и непосредственно для лечения какого-либо заболевания(4). В связи с вышеизложенным, нам было интересно изучить химический состав известного и широко применяемого в народной медицине для лечения различных хронических заболеваний сока листьев лопуха гладкосемянного, а также изучить его влияние на иммунную систему экспериментальных животных.
Материалы и методы исследования. Приготовления сока листьев лопуха гладкосемянного (ЛГ). Сбор листьев проводили в мае-июне в горах Толебийского района Южно-Казахстанской области. Собирали наиболее развитые, крупные листья, которые тщательным мытьем под проточной водой очищали от посторонних органических минеральных примесей. Затем для измельчения сырье пропускали через мясорубку и с помощью пресса выдавливали сок. К каждым 85 частям сока прибавляли по весу 15 частей 95% этилового спирта, смесь помещали в водяную баню при температуре 850С. После того как температура сока достигала 77-780С, его выдерживали в течение 30 минут при комнотной температуре. Для быстрого охлаждения смесь ставили под проточную холодную воду. Целью быстрого нагревания и охлаждения являлась инактивация ферментов и свертывание белковых веществ. Денатурированию последних способствовало добавление спирта.
Выпавший осадок отделяет центрифугированием. Приготовленный сок стабилизировали метабисульфитом натрия (0,15% от общего веса) (5).
Химические и физико-химические методы анализа сока ЛГ. Химические анализ сока ЛГ проводили качественными и количественными методами (6). Использовались осадительные и специальные реактивы, которые добавляли соку ЛГ. Тонкослойная хроматография (ТСХ) в системе н-бутанол-уксусная кислота проводилась на пластинках силикагель фирмы <<Мерк>>. Хромотограммы рассматривали в приборе <<CAMAG>> с ультрафиолетовым облучением.
Иммунологические методы. Для достижения поставленной цели нами был выбран комплекс тестов, апробированных в экспериментальной иммунологии и, на наш взгляд, достаточно полно и адекватно характеризующих ключевые события, происходящие в иммунной системе при воздействии извне. Этот комплекс включал: а) определение общего количества лейкоцитов и лимфоцитов с помощью общепринятого лабораторного метода; б) реакция торможения миграции лимфоцитов по Артемьевой А.Г. (1973г.); в) определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови; г) определение антителообразующих клеток в селезенке по Ерне-Нордин(1973г.). Антигеном служили эритроциты барана, взятые путем пункции яремной вены. Постановка эксперимента. Сок из листьев ЛГ вводили 25 беспородным белым крысам из расчета 1,0 мл/кг веса, то есть по 6 капель внутрижелудочно однократно в течение 14-и дней с помощью желудочного зонда.
Результаты исследований. Внешний вид. Сок коричнево-красного цвета с обильным осадком, со специфическим запахом и горьким вкусом. Исследование дубильных веществ. Для определения дубильных веществ исследованный сок разбавляли водой 1:1 и разбавленным раствором проводили следующие реакции: при добавлению к раствору 3% раствора железноокисного хлорида образовывалось зеленовато-черное окрашивание (дубильные вещества пирокитохи-новой группы); при добавлении к раствору бромной воды выпадал желтоватый осадок; при добавлении к исследованному соку раствора желатины выпадал хлопьевидный осадок желтоватого цвета. Результаты вышеизложенных химических реакций свидетельствовали о наличии дубильных веществ в исследованном объекте.
Исследование аскорбиновой кислоты (витамина С) в составе сока. Для индентификации аскорбиновой кислоты к разбавленному соку добавляли 2% водный раствор серебра нитрата. Выпадение мутного сероваточерного осадка свидетельствовало о наличии аскорбиновой кислоты. Полученные при помощи качественной реакции данные удостоверяли методом ТСХ: система н-бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 4:1:5 на пластинке силикагель фирмы «Мерк». Количество наносимого вещества 2 мкл. Наряду с исследованным веществом нанесен стандарт аскорбиновой кислоты. Проявитель - раствор дихлорфенолиндофенола. Результаты хроматогра-фического изучения также свидетельствовали о наличии аскорбиновой кислоты в исследованном объекте. Количественное содержание аскорбиновой кислоты проведено методом титрования по Государственной Фармакопее XI (стр 295). При трехкратном анализе было установлено, что содержание аскорбиновой кислоты находилось пределах 1,6-3,3%).
Исследование флавоноидов. Для исследования флавоноидов использован метод ТСХ. Система н- бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 4:1:5 на пластинках силикагель фирмы «Мерк». Хроматограмму рассматривали в приборе «САМО» с УФ облучением. При этом наблюдались 2 пятна со значениями Rf (фактор удерживания) 0,63 и 0,30. Следующая система -60% уксусная кислота. Объем наносимого вещества - 1 мкл. Наблюдалось 1 пятно со значением Rf 0,84. При длине волны 254 нм данное пятно имело грязно-фиолетовую окраску, при длине волны 366 нм имело голубую флюо-рисценцию. Это свидетельствовало о том, что при использовании 15%) и 60%> уксусной кислоты идентифицировались одни и те же флавоноиды. Результаты качественных реакций - с раствором хлористого алюминия - желтый осадок, реакция с щелочами (интенсивно-желтое окрашивание), цианидиновая проба (розовато-малиновое окрашивание) также свидетельст вовали о наличии флавоноидов в исследованном объекте.
Исследование полисахаридов. В 0,5 мл сока ЛГ добавляли 0,5% раствор фенола (0,5 мл) и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Образовывался бурый цвет, свидетельствовавший о наличии полисахаридов (допустимо темно-красное окрашивание). Количественное определение полисахаридов проведено гравиметрическим методом при осаждении последних ацетоном в соотношении 1:2. В результате трехкратного анализа было установлено, что содержание полисахаридов составляло в пределах 0,72%>. Изучение азотосодержащих соединений. Азотосодержащие компоненты исследованы после обработки данного сока 2% раствором уксусной кислоты в соотношении 1:2, последующей фильтрацией и обработкой реактивами: реактив Драгендорфа - положительный результат; реактив Майера - положительный результат; 10% раствор танина - положительный результат; 1% раствор пикриновой кислоты - положительный результат; Положительные реакции с общеосадочными реактивами свидетельствовали о наличии азотосодержащих компонентов в исследованном соке.
Исследование кумаринов. Для исследования кумаринов сок обрабатывали метанолом и спиртовым раствором щелочи. После нейтрализации щелочи 10% раствором хлористоводородной кислоты кумарины извлекали эфиром. Эфирное извлечение сгущали и хроматографировали в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5). Объем нанесенного проявителя-извлечения - 2 мкл. Проявитель - диазотированнный паранитроанилин. Наблюдалось 1 пятно бледно-фиолетового окрашивания, свидетельствовавшее о наличии кумарино. Показатели иммунитета. Результаты оценки торможения миграции лейкоцитов в ответ на стимуляцию Кон-А свидетельствовали о временном угнетении неспецифической лимфокин-секретирующей активности Т-лимфоцитов периерической крои опытных животных на 6-е сутки эксперимента. В данный период средние значения ИТМЛ у животных, получавших сок ЛГ, статистически значимо превышали соответствующий показатель группы контроля (0,86+0,)3 и 0,64+0,02; р<0,001). На 9-й, 14-й дни этот показатель возвращался к норме (0,70+0,08 и 0,67+0,05 соответственно). Уровень содержания ЦИК за весь период наблюдения существенно не изменялся относительно контрольного показателя. Фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов статистически достоверно снижалась на 6-е сутки опыта: в данный срок исследуемый показатель в опытной группе существенно снижался, составив 53,3+1,6% (дефицит относительно контроля -18,1%; р<0,01). Однако в последующие периоды исследования фагоцитарная активность микрофагов возвращалась к норме.
По количеству определяемых АТОК в селезенке предварительно иммунизированных эритроцитами барана крыс, нами было обнаружено достоверное снижение компетентности иммунной системы также на 6-е сутки эксперимента, когда средние значение АТОК в опытной группе статистически были ниже контрольных границ (56,1+2,0 на 1 мм ткани селезенки; дефицит 24,0%).
Выводы: 1. В результате исследования физико-химического состава сока из листьев лопуха ЛГ установлено наличие в нем азотосодержащих соединений, дубильных веществ, аскорбиновой кислоты (1,63,3%), кумаринов, флавоноидов, полисахаридов(0,72%). 2. Воздействие сока ЛГ в течение 14-и дней не оказывало существенного влияния на иммунную систему интактных животных, однако на 6-е сутки от начала введение сока ЛГ происходило транзиторное снижение функциональной активности иммунитета, восстанавливавшееся на 9-14-е сутки эксперимента.
ЛИТЕРАТУРА
- Лусс Л.В., Некрасов А.В., Пучков Н.Т. Роль иммуномодулирующей терапии в общеклинической практике // Иммунология.-М.,2000.-5.-С.34-37.
- Земсков В.М., Земсков А.М., Принципы дифференцированной иммунотерапии на антиген // Иммунология. -.,2009.-3.- С.4-6.
- Петрова Г.Б., Пугач П.В. Влияние различных способов иммуностимуляции на строение иммунокомпетентных органов // Морфология.-М., 1996.-Т.109,№2.-С.79.
- Ширинский В.С., Жук Е.А. Проблемы классификации и диагностики вторичных иммунодефицитов.- Новосибирск, 2008.-С.42.
- Есенова Ж.Х. Влияние сока лопуха большого на иммунологическую реактивность при двигательно-эмоциональном стрессе и острой фосфорной интоксикации // Автореф. Квнд. Дис. -Алматы, 1999.-25с.
- Беликов В.Г. Фармацевтическая химия.-М.:высшая школа, 1985.-767с.