Использование комплекта реагентов «ДНК-СОРБ-В» для выделения ДНК из различных объектов биологического происхождения в криминалистических целях

Выделение ДНК из исследуемых объектов является первым и наиболее важным этапом молекулярно-генетического исследования. От качества его исполнения зависит успех всех последующих этапов исследования и конечный результат. Неправильный выбор метода выделения ДНК или его неверное осуществление могут привести либо к получению загрязненной ДНК, непригодной для исследования, либо вообще к потере ДНК. Поэтому, прежде чем приступать к выделению ДНК, нужно тщательно продумать последовательность действий, выбрать протокол выделения ДНК, соответствующий характеру объектов и имеющимся реактивам. При выборе метода выделения необходимо учитывать вид объекта, его состояние, давность образования наслоений, условия хранения.

Наиболее распространенными в экспертной практике объектами биологического происхождения, из которых можно выделить ДНК, являются следующие: кровь в жидком и высушенном виде, в том числе пятна крови на различных предметах одежды и вещной обстановки; сперма и смешанные наслоения; мышечная ткань и ткани других внутренних органов (печень, сердце, легкие, хрящевая ткань и др.); костная ткань; волосы.

Выделение ДНК в настоящее время проводят следующими наиболее распространенными методами: а) с помощью органических соединений - таких, как фенол и хлороформ (фенольный метод); б) с помощью неионных детергентов; в) с помощью абсорбирующих ДНК веществ - таких, как соединения кремния и магнитные сорбенты; г) с помощью ионообменных смол (например, Chelex).

Реактивы для выделения ДНК как правило готовятся непосредственно в лаборатории, либо используются готовые коммерческие наборы.

Каждый из этих методов обладает как преимуществами, так и недостатками. К недостаткам чаще всего относятся: дороговизна используемых коммерческих наборов, недостаточно высокая очистка ДНК, необходимость использования большого количества исходного биологического материала, что не всегда возможно, низкий уровень выхода ДНК, токсичность используемых реагентов и др.

В лаборатории молекулярно-генетической экспертизы Центра судебной экспертизы МЮ РК для выделения ДНК в различное время были опробованы различные методы, преимущественно с использованием готовых коммерческих наборов.

Очень хорошо зарекомендовал себя коммерческий комплект реагентов «ДНК-сорб-В» (производство АмплиСенс, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Россия), который с успехом используется нами на протяжении 7 лет. В состав данного набора входят:

1) Лизирующий раствор
2) Раствор для отмывки 1
3) Раствор для отмывки 2
4) Сорбент универсальный
5) ТЕ-буфер для элюции ДНК 

Данный комплект реагентов рекомендован производителем для выделения ДНК из клинического материала. Однако, нами данный комплект реагентов, после соответствующей модификации протокола, был использован также для выделения ДНК из различных объектов биологического происхождения, поступающих на молекулярно-генетическую экспертизу, таких как сухая кровь, сперма, смешанные выделения, волосы, мышечная ткань и ткани органов, костная ткань.

Преимуществами использования данного набора реактивов являются: отсутствие высокотоксичных реактивов; относительно низкая стоимость; возможность использования стандартного лабораторного оборудования; возможность выделения ДНК из любого объекта биологического происхождения, в том числе и костной ткани; простота исполнения, не требующая каких-либо специальных навыков; довольно высокий выход ДНК (от 10 нг для костной ткани, до 1000 нг для жидкой крови).

К недостаткам можно отнести длительность процедуры выделения для отдельных видов объектов (костная ткань, ткани органов, волосы).

Модифицированные протоколы выделения ДНК для различных объектов биологическо происхождения с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» приведены ниже.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ЖИДКОЙ КРОВИ

Протокол

1. В промаркированные пробирки внести по 300 мкл лизирующего раствора и 100 мкл пробы.
2. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 минут при 65°С (если вы работаете плазмой крови, прогревать пробу не нужно). Центрифугировать пробирки 5 с при 5 тыс. об/мин микроцентрифуге. Если    проба   растворилась    не    полностью,    центрифугировать пробирку микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах и использовать для выделения ДНК надосадочну жидкость, перенеся ее в новую пробирку.
3. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельнь наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить штатив на 2 минуты, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 минут.
4. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс.об/мин в течение 30 с. Удали супернатант.
5. Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе для полно ресуспендирования сорбента.   Осадить      сорбент   центрифугированием   при   5   тыс. об/мин микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить супернатант.
6. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полно ресуспендирования сорбента, отцентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удали супернатант.
7. Повторить процедуру отмывки, следуя п.6, отобрать супернатант полностью.
8. Поместить пробирки в термостат 65°С на 5-10 минут для подсушивания сорбента. При эт< крышки пробирок должны быть открыты.
9. В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортею Поместить в термостат 65°С на 5 минут, периодически встряхивая на вортексе.
10. Центрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 минуты на микроцентрифу Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ПЯТЕН КРОВИ

Пятна крови, исследуемые в ходе молекулярно-генетической экспертизы, могут бь: локализованы на самых различных предметах-носителях, различной давности и условий хранения.

Если пятна крови расположены на ткани (предметы одежды, предметы вещной обстановки ножницами вырезают пятно размером около 1 кв.см., затем фрагмент ткани осторожно разволакиваю' помощью пинцетов на отдельные волокна или измельчают ножницами. Полученные нарезки помещаю' чистую промаркированную пробирку объемом 1,5-2 мл. Для получения достаточного количества ДІ необходимо, чтобы пятно пропитывало и уплотняло ткань. Однако избыток крови в пятне, например, ее имеется корочка на поверхности пятна или сделана вырезка ткани большего размера, могут привесті снижению качества и количества выделенной ДНК.

Если на поверхности пятен имеются выраженные наслоения плесневых грибов, то вместе с Д1 человека будет выделена ДНК микрофлоры, что может исказить реальные результаты при количествен^л; оценке выделенной ДНК.

Если размер пятна составляет менее 1 кв.см, или пятно не пропитывает и не уплотняет ткань присутствует в виде помарки либо мазка, то из такого объекта ДНК может быть выделена, но в менып количестве или же не выделиться совсем. В данном случае все зависит от конкретного объекта.

В зависимости от вида пятна, срока давности его образования, размер вырезки может бь уменьшен или увеличен. Чем старее пятно, тем труднее из него выделить ДНК.

Если пятна крови расположены  на предметах с твердой поверхностью  (полы,   стены, ноз топоры, палки и т.д.) - чистый марлевый тампон смачивают в дистиллированной воде или лизируюи растворе и  протирают поверхность с  наслоениями вещества. Затем тампон разволакнивают \ измельчают и используют для выделения ДНК.    Использовать для смывов спиртовый раствор рекомендуется, так как он наоборот фиксирует пятна на поверхности.

Протокол

1. В промаркированные пробирки внести подготовленные нарезки и 500 мкл лизирующего раствора. Встряхнуть на вортексе.
2. Добавить 12,5 мкл Протеиназы К и инкубировать в течение 3 часов при температуре 56°С (или в течение ночи при температуре 37°С) при периодическом перемешивании.
3. Осторожно перенести раствор в чистую пробирку, оставляя предмет-носитель на дне. Центрифугировать 2 минуты при максимальных оборотах (13-16000 об/мин) на микроцентрифуге. Использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новые пробирки.
4. Далее проводят выделение ДНК начиная с п.З протокола «Выделение ДНК из жидкой крови».
   ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ СПЕРМЫ И СМЕШАННЫХ ПЯТЕН

Чаще всего объекты, содержащие сперму, представляемые для молекулярно-генетического исследования, имеют смешанный характер. То есть присутствует сперма не в чистом виде, а в смеси с кровью или влагалищными выделениями, эпителиальными клетками. Для того, что провести качественное исследование, необходимо отделить сперматозоиды от других клеток и раздельно выделить ДНК. Это достигается путем применения дифференциального лизиса, в основе которого лежит различие в строении клеточной стенки сперматозоидов и клеток крови, эпителия и др.

Дифференциальный лизис клеток можно использовать для выделения ДНК из любых объектов, содержащих сперму. Дифференциальный лизис состоит из нескольких этапов:

• Экстракция биологических наслоений с объекта-носителя
• Цитологическое исследование
• Лизис условно «женской» фракции (эпителии влагалища, кровь)
• Лизис условно «мужской» фракции (сперматозоиды, ядра сперматозоидов без оболочки) Предварительно с объекта-носителя делают вырезку ткани размером приблизительно 1 кв.см, с

наслоениями вещества. Размер вырезки зависит от вида объекта, давности его образования и условий хранения.

Протокол

1. В промаркированные пробирки внести подготовленные нарезки, залить 1 мл деионизованной воды (частички объекта-носителя должны плавать свободно в растворе). Встряхнуть на вортексе. Инкубировать при постоянном перемешивании на ротамиксе при комнатной температуре в течение 1-2 часов (или в течение ночи при температуре 4-8°С).
2. Осторожно перенести раствор в чистую пробирку, оставляя предмет-носитель на дне. Центрифугировать 2 минуты при максимальных оборотах (13-16000 об/мин) на микроцентрифуге. Супернатант удалить, оставив приблизительно 30-50 мкл. Суспендировать осадок в оставшемся объеме.
3. Провести цитологическое исследование клеточного осадка:

а)  Змкл взвеси клеток поместить на предметное стекло и подсушить;

б)  клетки фиксировать этанолом в течении 15 мин либо путем прогревания препарата в термостате
при температуре 56°С в течение 30 мин;

в)  окрасить препарат свежеприготовленной азур-эозиновой смесью (соотношение смеси эозин-
вода-азур 1:3,5:1,5) в течение 20 мин при комнатной температуре. Смыть краску дистиллированной водой,
и высушить препарат;

г)  микроскопировать препарат, используя объектив 90^х масляной иммерсии. При обнаружении
сперматозоидов проводят дальнейшее исследование. Если в препарате имеются эпителиальные клетки, то
выполняют процедуру дифференциального лизиса (начиная с п. 4). Если эпителиальных клеток (или
клеток крови) не обнаружено, то, не проводя процедуру дифференциального лизиса, переходят к
выполнению действий п.6.

4. Лизис эпителиальных клеток (клеток крови):

а)  к клеточному осадку добавить 300 мкл лизирующего раствора. Инкубировать в течение 1-2
часов при температуре 56°С при периодическом перемешивании. Для предотвращения преждевременного
лизиса спермы инкубацию проводить не более 2 часов;

б)  центрифугировать содержимое пробирки в течение 20 минут при максимальной скорости;

в)    осторожно  перенести  супернатант  в  чистые  промаркированные  пробирки. Супернатант
содержит продукты лизиса клеток эпителиальной фракции. ДНК эпителиальной фракции может быть
очищена параллельно с ДНК спермальной фракции. Осадок содержит сперматозоиды.

5. Отмыть осадок, содержащий сперматозоиды:

а) суспендировать осадок в 0,5 мл лизирующего раствора;

б) центрифугировать в течение 5 минут при максимальной скорости;

в) осторожно удалить супернатант.

В случае, когда отношение количества эпителиальных клеток к количеству сперматозоидов слишком велико, рекомендуется промыть осадок еще раз.

г) суспендировать осадок в 1 мл деионизованной воды;

д)    центрифугировать в течение 5 минут при максимальной скорости, осторожно удалить
супернатант. Провести цитологическое исследование осадка. Если в препарате кроме сперматозоидов
присутствуют еще и эпителиальные клетки, то процедуру дифференциального лизиса необходимо
повторить, сократив время инкубации при температуре 56°С до 30 минут, и повторить отмывание осадка.

6. Провести лизис сперматозоидов: к осадку добавить 500 мкл лизирующего раствора, 15 мкл Протеиназы К , 20 мкл 1МDTT или 1М В-МЭТ. Перемешать на вортексе. Инкубировать при температуре 56°С в течение 3 часов. При необходимости время лизиса может быть увеличено до 6-18 часов.

Далее параллельно проводят очистку раствора ДНК эпителиальной и спермальной фракции.

7. Далее проводят выделение ДНК начиная с п.З протокола «Выделение ДНК из жидкой крови».

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ТКАНЕЙ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ. Для выделения ДНК подходят фрагменты мышечной ткани, печени, легких и др., хрящевой ткани без гнилостных изменений и/или мумифицированные фрагменты размером приблизительно 5x5 мм. Ткани предварительно измельчаются.

Протокол

1. Фрагмент ткани размером приблизительно 5x5 мм измельчить с помощью скальпеля, поместить в микропробирку объемом 1,5 мл, залить 500 мкл лизирующего раствора.

Примечание: размер фрагмента может быть увеличен в зависимости от объекта, сроков и условий его хранения.

2. Добавить 15 мкл раствора Протеиназы К, тщательно перемешать на вортексе.
3. Инкубировать при температуре 56°С в течение 6-18 ч до растворения фрагмента ткани, периодически перемешивая на ротамиксе.
4. Центрифугировать продукты лизиса в течение 1 мин при максимальных оборотах для отделения нерастворившихся компонентов и перенести супернатант в чистую пробирку.
5. Далее проводят выделение ДНК начиная с п.З протокола «Выделение ДНК из жидкой крови». ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ

Для выделения ДНК из костной ткани лучше всего подходит компактное вещество, из которого состоят плоские кости: лопатки, ребра, кости черепа, головки трубчатых костей.

Предварительно исследуемую кость или ее фрагмент отмывают от остатков мягких тканей и поверхностно стерилизуют в 3% растворе перекиси водорода в течение 18 ч. После этого ополаскивают кость дистиллированной водой, высушивают и измельчают. Измельчение можно проводить с помощью напильника, лобзика, стоматологического бора или других инструментов. В процессе измельчения необходимо следить, чтобы кость не нагревалась, так как это может привести к деградации ДНК. Все инструменты должны быть перед использованием и после тщательно простерилизованы. Измельчение также можно проводить с использованием жидкого азота. Для этого фрагмент кости помещают в фарфоровую ступку, заливают жидким азотом, выдерживают до стадии глубокой заморозки и затем тщательно растирают пестиком.

Количество костного порошка, приготовленного для выделения ДНК, не должно быть менее 1 г.

Протокол

1. В пробирку объемом 15 мл поместить 1-2 г. костного порошка, залить 7,5 мл лизирующего раствора. Добавить 225 мкл Протеиназы К (10 мг/мл) и 300 мкл 1М раствораDTT. Содержимое пробирки тщательно перемешать.
2. Инкубировать при температуре 56°С в течение 6-8 часов или при температуре 37°С в течение 18 часов при периодическом перемешивании.
3. К продуктам лизиса снова добавить 225 мкл Протеиназы К (10 мг/мл) и 300 мкл Ш раствора DTT. Тщательно перемешать.
4. Инкубировать при температуре 56°С в течение ночи.
5. Центрифугировать продукты лизиса в течение 5 мин. при 10 ООО об/мин для отделения нерастворившихся компонентов и перенести супернатант в чистую пробирку.
6. Далее проводят выделение ДНК начиная с п.З протокола «Выделение ДНК из жидкой крови».
   ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ВОЛОС

Для проведения молекулярно-генетического исследования пригодны вырванные и выпавшие волосы, обязательно имеющие луковицу. Луковица корня волос обычно содержит от 100 до 1000 клеток эпидермиса, из которых и выделяют ДНК. Стержень волос состоит из мертвых клеток, непригодных для выделения ДНК.

Перед выделением ДНК исследуемый волос промывают в деионизованной воде. Затем, используя бинокулярную лупу, стерильным скальпелем отрезают луковицу с фрагментом стержня длиной около 1 см.

Протокол

1. Поместить фрагмент волоса с луковицей в микропробирку объемом 1,5 мл, залить 500 мкл лизирующего раствора.

Примечание: так как поверхность волоса может быть загрязнена посторонними биологическими следами (например, кровью), то для контроля чистоты выделения ДНК параллельно проводят процедуру выделения ДНК из фрагмента волоса длиной 5-10 мм, срезанного со стороны периферического конца. Полученную пробу используют в качестве контроля при постановке реакции амплификации.

2. Добавить 15 мкл Протеиназы К (10 мг/мл) и 20 мкл Ш раствораDTT. Содержимое пробирки тщательно перемешать.

Внимание! Стержень волоса должен быть полностью погружен в лизирующий раствор.

3. Инкубировать при температуре 56°С в течение 6-8 часов или при температуре 37°С в течение 18 часов при периодическом перемешивании. За это время волос размягчается, однако полностью не растворяется.
4. Содержимое пробирки тщательно перемешать с использованием вортекса в течение 5-10 сек.
5. К продуктам лизиса снова добавить 15 мкл Протеиназы К (10 мг/мл) и 20 мкл 1М раствора DTT. Тщательно перемешать.
6. Инкубировать при температуре 56°С в течение 6-8 часов или в течение ночи. За это время волос практически полностью растворяется.
7. Центрифугировать продукты лизиса в течение 1 мин. при 10 000 об/мин для отделения пигмента и нерастворившихся компонентов и перенести супернатант в чистую пробирку.
8. Далее проводят выделение ДНК начиная с п.З протокола «Выделение ДНК из жидкой крови».
   Внимание: все биологические объекты, из которых выделяют ДНК, считаются потенциально

опасными, инфицированными. Работать только в перчатках, в халате, при необходимости использовать защитную маску, очки. Рабочие поверхности и пипетки перед началом работы и по окончании обрабатывать спиртом. Использованные одноразовые наконечники сбрасывать в контейнер с дезинфицирующим раствором.

Для увеличения выхода ДНК рекомендуется после 5 минут элюции при 65°С оставить раствор с сорбентом на ночь в холодильнике. После чего отцентрифугировать и использовать супернатант с растворенной ДНК. Выход ДНК при этом увеличивается не менее чем в 2 раза.

Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при 2-8°С, и в течение 1 года при минус 20°С.

Полученные нами препараты ДНК затем использовались для постановки ПЦР как в монолокусном формате для ручного типирования, так и в мультилокусном формате для типирования с использованием генетического анализатора. При этом каких-либо различий по сравнению с препаратами ДНК, полученными другими методами, не было выявлено.

Таким образом, комплект реагентов «ДНК-сорб-В» с успехом может использоваться для выделения ДНК из различных объектов биологического происхождения, поступающих на молекулярно-генетическое исследование.