Антибиотикорезистентность штаммов enterobacteriaceae, выделенных от пациентов многопрофильных стационаров

В данной работе представлены этиологическая структура хирургических инфекций в многопрофильных стационарах г.Алматы (214 клинически значимых бактериальных изолятов), распределение видов выделенных энтеробактерий, результаты оценки чувствительности к антибактериальным препаратам 82 изолятов Enterobacteriaceae. Энтеробактерии составили в общей сложности 38,32% всех выделенных бактериальных возбудителей, наиболее частыми видами были Escherichia coli (23,83%) и Klebsiella pneumonia (4,21%). Продукция β-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL) обнаружена у 56,1% изолятов Enterobacteriaceae, в том числе, у 70,59% E.coli и 77,78% K.pneumoniae. При генотипической детекции у всех резистентных к цефалоспоринам III–IVпоколений штаммов E.coli в геноме и в плазмиде регистрировались гены TEM, из них 43,5% - изоляты, несущие только ген TEM; 43,5% - изоляты, несущие одновременно гены двух групп бета-лактамаз TEM1+CTX-M1; 13% - комбинацию генов TEM1+CTX-M1+OXA. У всех 7 резистентных к цефалоспоринам штаммов K.pneumoniae в геноме и плазмиде выявлены гены TEM-1, у 4 штаммов - комбинация генов TEM-1+CTX-M-1. 

Введение. Известно, что в этиологической структуре нозокомиальных и внебольничных инфекций ведущая роль принадлежит энтеробактериям. По результатам многоцентрового эпидемиологического исследования антибиотикорезистентности возбудителей нозокомиальных инфекций МАРАФОН в 2011-2012 гг. в стационарах России энтеробактерии составили в общей сложности 33,7% всех выделенных бактериальных возбудителей. Наиболее частыми видами были Klebsiella pneumoniaе (16,9%), Escheriсhia coli (7,9%) и Enterobacter cloacae (2,6%) [1].В сравнении с аналогичными показателями, полученными в исследованиях, проведенных в России ранее, отмечалась тенденция к нарастанию: доля изолятов Enterobacteriaceae составила в 20022004 гг. 30,1% и 34,5% в 2006-2007 гг. [2, 3].

Наиболее клинически значимой является проблема резистентности грамотрицательных бактерий к современным цефалоспоринам и карбапенемам вследствие эпидемического распространения штаммов, продуцирующих ß-лактамазы расширенного спектра действия[4,5,6,7, 8].

Гены, кодирующие ß-лактамазы описаны у многих возбудителей инфекций, особенно нозокомиальных. В разных регионах мира преимущественное распространение получили разные варианты таких генов. Наиболее значимыми в эпидемическом плане относятся гены, кодирующие БЛРС CTX-M-типа [9.10,11].

Целью настоящего исследования явилось изучение резистентности штаммов Enterobacteriaceae, выделенных от пациентов многопрофильных стационаров г. Алматы к бета – лактамным антибиотикам, анализ его молекулярных механизмов для выработки локальной эпидемиологической карты распространения bla-генов

Материалы и методы.В исследование были включены 214 клинически значимых бактериальных изолятов, собранные в рамках внутривузовского научного проекта: «Мониторинг резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций к антимикробным препаратам и изучение его молекулярных механизмов» в двух многопрофильных стационарах (отделений гнойной Klebsiella pneumoniae, антибиотикорезистентность, β- хирургии, урологии ГКБ г. Алматы №4, 12).

Материалом для микробиологических исследований служили: отделяемое раневых поверхностей, дренажей при абдоминальных инфекциях, моча. Из них 82 изолята – представители семейства Enterobacteriaceae, были изучены на предмет продукции БЛРС. Выделение и первичная идентификация бактериальных изолятов проводилась в лаборатории кафедры микробиологии КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова. Окончательная видовая идентификация и определение их чувствительности к антимикробным препаратам проводились в НКДЛ НИИ им. Атчабарова. Все исследованные изоляты были идентифицированы до вида и определена их антибиотикочувствительность на бактериологическом автоматизированном анализаторе "VITEK-2 Compact". Также дополнительно использовали классический дискодиффузионный метод определения антибиотикочувствительности на агаре Мюллера - Хинтона.

Для фенотипического выявления продукции БЛРС использовали метод двойных дисков [12]. По наличию расширенной зоны подавления роста между дисками с цефтазидимом (CAZ, 30 мкг), цефепимом (CPM, 30 мкг) и диском, содержащим комбинацию амоксициллина с клавулановой кислотой (AMC20/10 мкг). Для контроля качества определения чувствительности использовали штаммы E.coli ATCC 25922, K.pneumoniae ATCC 700603 (ESBL+).

Детекцию наиболее распространенных и клинически значимых генов класса А (TEM1, STX-M1, SHV, OXA) для культур с подтвержденным ESBL – фенотипом проводили методом ПЦР[13]. Выделение геномной и плазмидной ДНК грамотрицательных бактерий был произведен по стандартной методике с помощью набора Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit (выделение геномной ДНК) и Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit (выделение плазмидной ДНК) (TransGenBiotech, Китай). Использовалось 5 мл 18-20-часовой культуры бактерий.

Для проведения полимеразной цепной реакции на 4 пар генов БЛРС (TEM1, CTX-M1, SHV, OXA) использованные праймеры приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Использованные праймеры характеризуется определенной длиной, что дает нам качественные результаты.

Результаты исследования.

В этиологической структуре инфекций (n=214) в многопрофильных стационарах г.Алматы грамотрицательные микроорганизмы в совокупности занимают ведущую роль - 116 изолятов (54,2¿) . Доля изолятов семейства Enterobacteriaceae среди всех возбудителей хирургических инфекций составила - 82 (38,32¿), наиболее частыми видами были Escherichia coli (23,83¿) и Klebsiella pneumonia (4,21¿). Доля изолятов неферментирующих грамотрицательных бактерий составила - 31 (14,49%)

Для ПЦР реакции использовалось 10 пмоль каждых праймеров и 20 нг геномной и плазмидной ДНК бактерий, таким образом, проводилось 2 реакций на 1 образец. ПЦР проводилось следующей программой 95ºС - 5 мин, 95ºС 45сек, 53.5º (60º, 54º, 55ºС) 45 сек 35 циклов соответственно, 72ºС - 45 сек, и окончательный отжиг 72ºС - 10 мин. Использовался готовый мастер микс Platinum® PCRSuperMix (LifeTechnologies, CAUSA) объем реакции составлял 25 мкл, ПЦР проводился на BioRadIQ5 (BioRadLaboratories, Inc., CAUSA). Последующая детекция генов осуществлялась на 1¿ агарозном геле с добавлением этидиум бромида. Каждый ген

Распределение видов в этиологической структуре выделенных изолятов семейства Enterobacteriaceae представлена в таблице 1, из них наибольшее количество - 51 изолятов были представлены E.coli, K.pneumoniae - 9 штаммов; Proteus mirabilis - 5 штаммов и Enterobacter spp. - 3.

Таблица 2 - Видовой состав изолятов - представителей семейства Enterobacteriaceae (n=82)

Показатели степени чувствительности выделенных проявили 46 штаммов, что составило 56,1¿, из них

штаммов энтеробактерий даны в таблице 2. Из 82 36 - E.coli, 7 - K.pneumoniae, 2 - E.cloacae и 1штамм

изолятов семейства Enterobacteriaceae C.koseri.

резистентность к цефалоспоринам III - IV поколений

Таблица 3 - Чувствительность изученных штаммов энтеробактерий к АМП

Примечание. Ч - чувствительность, Р - резистентность, УР - умеренная резистентность.

Escherichia coli. Среди представителей семейства Enterobacteriaceae (n=82) E.coli выделяли в отделениях хирургических стационаров г.Алматы чаще всего (в 62,2¿ случаев). Наиболее активными антибактериальными препаратами в отношении исследованных штаммов E.coli были карбапенемы (эртапенем - 98,0¿ чувствительных штаммов, мерапенем - 94,29¿). Высокая частота устойчивости к цефалоспоринам III - IV поколений (цефтриаксон - 72,55¿ резистентных штаммов; цефтазидим - 47,06% резистентных, 21,57¿ умеренно резистентных штаммов) была обусловлена продукцией БЛРС, выявленной по тесту синергизма цефтазидима и амоксициллин/клавуланата (рисунок 2).

Среди цефалоспоринов наименьшая частота устойчивости была в отношении цефепима (резистентных штаммов - 11,43%, умеренно резистентных – 40,0%). Из аминогликозидовнаиболее активным в отношении E.coli был амикацин (чувствительных штаммов – 82,35%); к гентамицину были чувствительными – 66,67% и к тобрамицину – 56,86% штаммов. К фторхинолонам: ципрофлоксацину – отмечалась 60,78% резистентентность, левофлоксацину – 62,75% резистентности. При генотипическойдетекции у всех резистентных к цефалоспоринам III – IVпоколений штаммов E.coli в геноме и в плазмиде регистрировались гены TEM1, из них 43,5% - изоляты, несущие только ген TEM1; 43,5% - изоляты, несущие одновременно гены двух групп бета- лактамазTEM1+CTX-M1; 13% - комбинацию генов TEM1+CTX-M1+OXA (рисунок 3).

Klebsiella pneumoniae. Выделенные 9 штаммов K.pneumoniae составили 10,98% от всех представителей семейства Enterobacteriaceae (n=82). К цефалоспоринам III – IV поколений проявляли устойчивость 7 штаммов. К эртапенему и меропенему были чувствительны 8 выделенных штаммов. Чувствительность к аминогликозидам: амикацину сохраняли также 4 изолята, гентамицину и тобрамицину – 2 штамма. К фторхинолонам были резистентны 77,78% штаммов. При генотипической детекции у всех 7 резистентных к цефалоспоринам штаммов K.pneumoniae в геноме и плазмиде выявлены гены TEM-1, 4 штамма - комбинацию генов TEM-1+CTX-M-1.

Enterobacter cloacae. Было выделено 3 штамма

cloacae, что составило 4% от всех энтеробактерий. Из них 2 штамма проявили резистентность на все группы антибиотиков, кроме меропенема. Оба резистентных штамма при ПЦР-детекции несли гены TEM-1.

Обсуждение результатов и заключение.

Результаты данного исследования свидетельствуют о преобладании в этиологической структуре инфекций (n=214) в многопрофильных стационарах г.Алматы грамотрицательных микроорганизмов - (54,2%). Доля изолятов семейства Enterobacteriaceae среди всех возбудителей хирургических инфекций составила – 38,32%, наиболее частыми видами были Escherichia coli (23,83%) и Klebsiella pneumonia (4,21%).

Зарегистрированная высокая частота резистентности к современным цефалоспоринам у изолятов семейства Enterobacteriaceae (56,1%) и прежде всего, у E.coli (70,59%) и K.pneumoniae (77,78%), обусловленная распространением БЛРС исключает возможность их эмпирического применения для лечения внутрибольничных и внебольничных инфекций, вызванных энтеробактериями и определяет необходимость осуществления регулярного мониторинга чувствительности возбудителей инфекций в стационарах, и при необходимости коррекции стратегии антибиотикотерапии.

Полученные локальные данные о высокой частоте сочетанной устойчивости выделенных штаммов coli, K.pneumoniae к традиционно используемым не- ß-лактамным антибиотикам - аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин) –( 31 – 78%); фторхинолонам (ципрофлоксацин, левофлоксацин) – (60 – 78%), также не позволяет рекомендовать их широкое применение, за исключением случаев подтвержденной чувствительности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сухорукова М. В., Эйдельштейн М. В., СклееноваЕ. Ю ., Иванчик Н. В., ТимоховаА. В., Дехнич А. В., Козлов Р. С. и исследовательская группа «Марафон». Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011 – 2012 гг.// Клин микробиолантимикробхимиотер.- 2014.- №16 (4). – C.254-265.
2. Решедько Г. К., Рябкова Е. Л., Кречикова О. И., Сухорукова М. В., Шевченко О. В., Эйдельштейн М. В., Козлов Р. С., Туркутюков В. Б. и др. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России. //Клин микробиолантимикроб химиотер.-2008.- №8(2). - С.96-112.
3. Сидоренко С. В., Березин А. Г., Иванов Д. В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceaeк цефалоспориновым антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. -
4. - 49(3). - С. 6-16.
5. Ильина В. Н., Субботовская А. И., Козырева В. С., Сергеевичев Д. С., Шилова А. Н. Характеристика штаммов Enterobacteriaceae, продуцирующих БЛРСcTX-M типа, выделенных в кардиохирургическом стационаре // Клин микробиолантимикроб химиотер. - 2013. - 15(4). - С. 309-314.
6. Мудрак Д. Е. Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов-возбудителей нозокомиальных инфекций: Автореф. ... канд.биол.наук - М., 2010. - 22 с.
7. Степанова М. Н. Мутационная изменчивость СТХ-М ß-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichiacoli: Автореф. ... канд.биол.наук - М., 2011. - 23 с.
8. Poirel L., Gnadkowski M., Nordmann P. Biochemical analyzing extended-spectrum β-lactamase cTX-M-15 and of its structurally related β-lactamase cTX-M-3. // J. Antimicrob chemother. - 2002. - №50. - Р. 1031-1034.
9. Сoque T. M., Novais A., carattoli A. et al. Dissemination of clonally related Escherichia coli strains expressing extended- spectrum β-lactamase cTX-M-15 // Emerging Infectious Diseases. - 2008. - №14. - Р. 195-200.
10. Hawkey P. M., Jones A. M. The changing epidemiology of resistance // J Antimicrob chemother. - 2009. - №64. - Р. 3-10.
11. Фурсова, Прямчук С. Д., Абаев И. В., Ковалев Ю. Н., Шишкова Н. А. и др. Генетическое окружение генов blacTX-M, локализованных на коньюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - №11. - С. 3-10.
12. Эйдельштейн М. В. Выявление бета-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерий с помощью фенотипических методов // Клин микробиол антимикроб химиотер. - 2001. - №3(2). - С. 183-189.
13. Monstein HJ, O¨ stholm-Balkhed A, Nilsson MV, Nilsson M,Dornbusch K & Nilsson LE (2007) Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM and blaCTX-M genes in Enterobacteriaceae // APMIS. -2008. - 115. - Р. 14001408.