Способ неинвазивной цитологической диагностики и мониторинга диабета 2 типа включает в себя определение содержания гликогена в эпителиоцитах, а также индексов дифференцировки и ороговения цитограммы эпителия выстилающего типа слизистой оболочки полости рта на протяжении всего периода лечения препаратами групп метформина и сульфонилмочевины (на 2-е, 6-е и 12-е сутки), по величинам которых осуществляется диагностика, мониторинг и оценивается эффективность лечения.
Сахарный диабет характеризуется широчайшим распространением и продолжающимся стремительным эпидемиологическим ростом. Только за три последних года еще 86 млн человек пополнили ряды больных сахарным диабетом. Сегодня это 371 млн больных, а к 2025 году предположительно будет 552 млн [1]. Очень показательны статистические данные за 2012 год: более 50% больных не знают о своем заболевании, умерли 4,8 млн больных сахарным диабетом, затраты достигли 471 млрд. долларов США. В промышленно развитых странах распространение сахарного диабета среди взрослой популяции достигает 10% и более. В Казахстане число зарегистрированных больных сахарным диабетом превысило 2000 тысяч, тогда как к концу 70-х годов прошлого века незначительно превышало 30 тысяч.
Осложнения сахарного диабета обусловливают снижение качества и длительность жизни больных, резко уменьшают эффективность и во многом раз повышают затраты на лечение. По данным ВОЗ [1], ежегодно от осложнений сахарного диабета умирают около 4,5 млн человек, что превышает суммарную смертность от эпидемического гепатита и СПИДа. Установлено, что 15% бюджетных средств, выделяемых на здравоохранение, тратится на сахарный диабет. Из них 90% составляют затраты на лечение осложнений. Это требует разработки надежных, информативных и безопасных способов ранней диагностики и мониторинга сахарного диабета 2 типа, в частностинеинвазивнойэкспресс- цитологической технологии.
разработка экспресс-цитологическойнеинвазивной технологии диагностики и мониторинга компенсации сахарного диабете 2-го типа по данным изучения реактивности цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта (СОПР).
Цель работы – разработка надежного, достаточно информативного способа неинвазивной цитологической диагностики и мониторинга сахарного диабета 2 типа по данным изучения реактивности эпителия слизистой оболочки полости рта (СОПР).
В задачи исследования входило: выявление уровня глюкозы в крови, определение содержания гликогена в цитоплазме эпителиоцитов, подсчет цитограмм СОПР, определение индексов дифференцировки (ИДиф) и ороговения (ИО) эпителиальных клеток (СОПР) на различных этапах мониторинга заболевания.
Материал и методы исследования. Материалом для исследований послужили мазки со слизистой оболочки выстилающего, жевательного и специализированного типов от 142 здоровых людей (контрольная группа) и 136 больных сахарным диабетом 2 типа в возрасте от 43 до 73 лет.
Все больные были обследованы в 20 поликлинике г. Алматы. Диагноз: сахарный диабет 2 типа средней степени тяжести. У исследованных больных диагноз был верифицирован в соответствии с Международными программами и основывался на критериях ВОЗ (1994 г.).Для гигиенической оценки состояния слизистой оболочки полости рта использовали гигиенический индекс Грина и Вермильена[2]. При этом отбирались испытуемые с гигиеническим индексом равным 0, что соответствует норме. Забор материала проводился в 8.00-8.30 утра натощак. У всех исследованных пациентов определялся уровень глюкозы в крови.
Обследуемая группа людей была однородной по биоритмологическому типу (утренний тип). Мазки забирались на 2-ой день, а также на 6 и 12-14 дни после лечения метформином и сульфонилмочевиной на фоне использования фитопрепарата «Ювелакс». После тщательно прополаскивания полости рта физиологическим раствором материал со слизистой оболочки полости рта забирали мягким движением без приложения силы путем соскоба стерильным металлическим шпателем, чтобы в собранную ротовую жидкость попали не насильственно соскобленные, а естественно отделившиеся клетки, переносили его на адгезивные предметные стекла и изготавливали тонкие мазки. Приготовленные мазки высушивали, фиксировали в спирт-ацетоне (1:1) в течение 5 минут и окрашивали метиленовым синим по Май-Грюнвальду (15 мин.) и азур-эозином по Романовскому-Гимза (30 мин.). Для изучения содержания и распределения в цитоплазме гликогена препараты окрашивались с помощьюШИК- реакции[3].
Для морфометрического исследования использован морфоденсито-метрический комплекс фирмы Leica: микроскоп DM 1000 (при увеличениях х 200, х 400, х 630 и х 1000), цифровая камера DFC-320 и компьютер (Pentium 4Б 128 M6 ОЗУ, видеокарта 64 Мб, операционная система Мicrosoft WindowsXP). С помощью этого комплекса получали изображения эпителиоцитов каждой стадии дифференцировки в формате JPG. Затем в клетках определенной стадии дифференцировки цитометрически при помощи программы PhotoM1.21 [4] после проведенной калибровки с помощью объект-микрометра определяли площади клеток и их ядер в мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение – ЯЦО. При денситометрическом исследовании гликогена в цитоплазме эпителиоцитов определяли два показателя: среднюю плотность и содержание исследуемого вещества в цитоплазме.
На мазках из расчета на 1000 клеток определяли эпителиоциты различных стадий дифференцировки, в том числе дистрофически измененные, с инвазией нейтрофилов
микроорганизмами.
мононуклеары и контаминированные
Кроме того, выявляли с цитоплазмой, голоядерныемононуклеары, сегментоядерные нейтрофилы и лимфоциты.
После подсчета цитограмм на мазках со слизистой оболочки полости рта вычисляли индексы дифференцировки (ИДиф)[5] и ороговения (ИО)[6]. ИДиф вычисляют по формуле:
А=1а+2б+3в+4г+5д+6е, где А – индекс дифференцировки эпителиальных клеток в мазках, 1, 2, 3, 4, 5, 6 – цифровые обозначения 1-ой, 2-ой, 3-ей, 4ой, 5-ой и 6-ой стадий дифференцировки эпителиоцитов; а, б, в, г, д, е – процент клеток соответствующей стадии дифференцировки.
ИО – отношение количества ороговевших плоскоэпителиальных клеток к общему числу эпителиальных клеток в процентах. ИОЭК вычисляют по формуле:
ИО= ∑ОЭК/n х 100, где ∑ОЭК – количество эпителиальных клеток, n – общее число эпителиальных клеток.
Анализ полученных данных и оценку достоверности различий средних проводили с использованием критерия Стьюдента с помощью профессионального пакета статистических программ StatSoft (USA) “Statistica – 6”. Изменения показателей считали достоверными при Р< 0,05. Для корреляционного анализа определяли коэффициенты корреляции Пирсона (r). Для проведения настоящей работы было получено разрешение этического комитета КРМУ (протокол №5, 2012 года).
Результаты исследований и обсуждение. Для удобства подсчета цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта по цитологическим, гистохимическим и морфометрическим параметрам идентифицировали шесть стадий их дифференцировки, суммированные в таблице 1.
Таблица 1 - Морфоденситометрические показатели эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта на различных стадиях дифференцировки
|
Показатели |
Стадии дифференцировки |
Р |
|||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
||
|
Площадь |
587,4± |
1088,1± |
4104,6± |
2463,6± |
2182,5± |
1323,2± |
Р1,2;2.3;3,4;4,5;5,6< 0,01 |
|
цитоплазмы , мкм2 |
15,6 |
39,3 |
104,2 |
61,1 |
61,2 |
96,43 |
|
|
Площадь |
144,3± |
125,3± |
119,6± |
108,7± |
26,6± |
Р1,2;3,4;4,5 < 0,01 |
|
|
ядра, мкм2 |
3,4 |
3,5 |
13,3 |
2,83 |
4,02 |
Р2,3 = 0,1 |
|
|
Ядерно- |
0,25± |
0,12± |
0,03± |
0,043± |
0,012± |
Р1,2;2.3;3,4;4,5;5,6 |
|
|
цитоплазма тическое отношение |
0,07 |
0,04 |
0,005 |
0,0014 |
0,002 |
< 0,01 |
|
|
Средняя |
0,07± |
0,082± |
0,2± |
0,14± |
0,081± |
0,053± |
Р2.3;3,4;4,5;5,6 < 0,01 |
|
оптическая плотность гликогена, усл.ед. |
0,003 |
0,005 |
0,01 |
0,007 |
0,0064 |
0,004 |
|
|
Средняя |
0,12± |
0,1± |
0,062± |
0,06± |
0,068± |
0,058± |
Р1,2;2.3 < 0,01 |
|
оптическая плотность суммарного белка, усл.ед. |
0,009 |
0,06 |
0,0043 |
0,0043 |
0,004 |
0,0043 |
|
Примечание: Р1,2;2.3;3,4;4,5;5,6 - достоверность различий средних показателей эпителиоцитов слизистой оболочки полости рта 1-ой и 2-ой, 2-ой и 3-ей, 3-ей и 4-ой, 4-ой и 5-ой, 5-ой и 6-ой стадий дифференцировки.
Таким образом, при идентификации эпителиоцитов различных стадий дифференцировки СОПР необходимо учитывать их характерные цитологические, цитохимические и морфоденситометрические особенности. Наиболее информативными для диагностики и мониторинга сахарного диабета 2 типа являются цитохимические и цитологические индикаторы эпителия СОПР выстилающего типа – содержание гликогена в эпителиоцитах различных стадий дифференцировки, ИДиф и ИО.
По данным изучения цитограмм слизистой оболочки полости рта выстилающего типа у больных сахарным диабетом в стадии компенсации установлено, что на второй день исследованияИДиф и ИО цитограммы СОПР выстилающего типа достоверно (Р< 0,05) возрастали по сравнению с контролем по всем изученным возрастным группам. ИДиф соответствовал 500,34±10,2 усл. ед., индекс ороговения соответствовал 10,5±0,73 усл. ед. На 6ой и в большей степени на 12-14 дни лечения препаратами метформина и сульфанилмочевины на фоне использования фитопрепарата «Ювелакс» ИДиф и ИО значительно снижались по сравнению со вторым днем (Графики 5 и 6), но не достигали контрольного уровня (Р> 0,05).
Характерные изменения наблюдались и при изучении содержания гликогена в эпителиоцитах 3- ей стадии дифференцировки: на второй день исследования у больных сахарным диабетом 2 типа содержание гликогена соответствовало 0,08±0,0065усл.ед. (рис.19), на 6-ой день - 012±0,007 усл.ед.(рис. 20) и на 12-14 дни – 0,17±0,009 усл.ед., приближаясь к контрольному уровню – 0,2±0,01.
Анализ корреляционных связей между биохимическими, гистохимическими и цитологическими параметрами у пациентов с сахарным диабетом 2 типа показал, что в парах между уровнем глюкозы в крови и содержанием гликогена в эпителиоцитах 3-ей стадии дифференцировки, между содержанием гликогена в эпителиоцитах 3-ей стадии дифференцировки и ИДиф эпителия слизистой оболочки полости рта выстилающего типа, между содержанием гликогена в эпителиоцитах 3-ей стадии дифференцировки и ИО эпителия слизистой оболочки полости рта выстилающего типа, между ИДиф и ИО эпителия слизистой оболочки полости рта выстилающего типа, между уровнем глюкозы в крови и ИДиф эпителия слизистой оболочки выстилающего типа и между уровнем глюкозы в крови и ИО эпителия слизистой оболочки полости рта выстилающего типа имеются сильные связи.
По всей вероятности, при гипергликемии, вследствие повышенного поступления глюкозы внутрь эпителиоцитов СОПР, происходит увеличение внутриклеточного количества продуктов гексозаминового шунта. Это по принципу обратной связи снижает поглощение эпителиоцитами СОПР глюкозы и синтез гликогена, что наблюдается при инсулинрезистентных состояниях [2]. Резкое уменьшение содержание гликогена в эпителии выстилающего типа смещает ход его дифференцировки в направлении ортокератоза.
Величины ИДиф и ИО цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта выстилающего типа и плотности гликогена в эпителиоцитах 3-ей стадии дифференцировки в норме и при сахарном диабете 2 типа, полученные по результатам наших исследований отражены в таблице 2.
Таблица 2 - Величины индекса дифференцировки (ИДиф) и индекса ороговения (ИО)цитограммы эпителия слизистой оболочки полости рта выстилающего типа и плотности гликогена в эпителиоцитах 3-ей стадии дифференцировкив норме и при сахарном диабете 2 типа
|
Контроль(норма) |
Сахарный диабет 2 типа |
||||
|
ИДиф (индекс дифференцировк и), усл. ед. |
ИО (индекс ороговения), усл. ед. |
Плотность гликогена в эпителио-цитах 3 ст. диф., усл. ед. |
ИДиф (индекс дифференцировки ) |
ИО (индекс ороговения) |
Плотность гликогена в эпителио-цитах 3 ст. диф., усл. ед. |
|
390,0-450,0 |
0-1,0 |
0,19-0,21 |
451,0-525,0 Г более |
1,1-30,0 и более |
0,07-0,179 |
Примеры мониторинга лечения сахарного диабета 2 типа сахароснижающими препаратами (сульфонилмочевиной и метформином) на фоне использования бальзама «Ювелакс»:
Пример 1. Больной Ас.,60 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа средней степени тяжести. Весь период лечения со 2 дня пребывания в стационаре получал перорально препараты групп метформина и сульфонилмочевинына фоне использования бальзама «Ювелакс». На 2-ой день исследования содержание глюкозы в крови в 8.00 утра натощак соответствовало 15,1 ммоль/л. На 2 день при цитологическом анализе мазков со слизистой оболочки полости рта выстилающего типа было отмечено, что ИДиф достигал значительной величины 498,48, свидетельствующий о явлении кератоза мукозальныхэпителиоцитов. На процессы кератоза эпителия указывает и очень высокая величина ИО равная 10,48. На 6-ой день лечения содержание глюкозы в крови уменьшалось до 10,3 ммоль/л., соответственно снижались и величины ИДиф (478,4) и ИО (3,4), однако они не достигали уровня нормы. На 12-ый день лечения содержание глюкозы в крови соответствовало 7,0 ммоль/л., соответственно изменялись ИДиф (463,7) и ИОЭК (3,2). Таким образом, выявлена сильная коррелятивная связь между содержанием глюкозы в крови и изученными цитологическими индексами (ИДиф и ИО).
Пример 2. Больная Со., 61 год. Диагноз: сахарный диабет 2 типа. Весь период лечения получал перорально препараты групп метформина и сульфонилмочевины на фоне использования бальзама «Ювелакс». На 2-ой день иследования содержание глюкозы в крови в 8.00 утра натощак равнялось 17,1 ммоль/л. При анализе цитограммы мазков со слизистой оболочки выстилающего типа были отмечены высокие величины ИДиф (500,0) и ИО (8,0), свидетельствующие о явлениях кератоза. На 6ой день терапии содержание глюкозы в крови снижалось до 10,2 ммоль/л., соответственно уменьшались и величины ИДиф (471,8) и ИО (3,4). Однако, выявленные величины индексов ИДифи ИО, как и содержание уровня глюкозы в крови не достигали уровня нормы. На 12-ый день лечения содержание глюкозы в крови соответствовало 7,3 ммоль/л., соответственно изменялись ИДиф (463,5) и ИОЭК (2,4). Таким образом, выявляется коррелятивная связь между содержанием глюкозы в крови и изученными цитологическими индексами (ИДиф и ИО). Предложенный способ оценивается как эффективный и достоверный для диагностики и мониторинга сахарного диабета 2 типа, что подтверждается параллельным анализом глюкозы в крови обследованного больного.
Заключение. Предлагаемый способ неинвазивной цитологической диагностики и мониторинга диабета 2 типа характеризуется как достоверный, легко выполним в любой патоморфологической лаборатории, не требует дорогих реактивов и оборудования и в 1,5-2,0 раза дешевле метода определения гликозилированного гемоглобина.
Новый способ диагностики и мониторинга оценки компенсации обменных процессов при сахарном диабете 2 типа отличается от уже известных способов тем, что при его использовании не происходит повреждения целостности кожных покровов, исключается риск заражения через кровь пациента и медицинского персонала, безболезненностью процедуры. Предлагаемый неинвазивный метод может быть использован для краткосрочного контроля за состоянием углеводного обмена при различных видах лечения у больных сахарным диабетом 2 типа.
Финансирование настоящего исследования проводилось за счет гранта ТОО Ассоциации «Акшам».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- IDF Diabetes Atlas 5thedition. 2012. Available from: http://www.diabetesatlas.org/
- Боровский Е.В. Терапевтическая стоматология. - М.: 1988. - 560 с.
- Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - М.: «Медицина», 1969. - С. 234-238.
- ЧерниговскийА. PhotoM 1.21 (Руководство пользователя). - 2011. http//t_lambda.chat.ru
- Быкова И.А., Агаджанян А.А., Банченко Г.В. Цитологическая характеристика отпечатков слизистой оболочки полости рта с применением индекса дифференцировки клеток // Лаб. Дело. – 1987. - № 1. – С. 33 – 35.
- Ергазина М.Ж., Р.И.ЮйПредпатент РК на изобретение, № 14227, № госрегистрации 2002/1184.1 от 25.09.2002.