Биопленка, как один из факторов высокой вирулентности микроорганизмов, выделенных из системы корневых каналов у детей

На базе модуля пропедевтики стоматологии детского возраста и ортодонтии было обследовано 16 подростков в возрасте 14-16 лет с диагнозом хронический фиброзный периодонтит. Из системы корневых каналов каждого пациента были взяты мазки для дальнейшего посева и идентификации чистых культур S.mutans и C.albicans. Далее статическим методом была изучена способность данных микроорганизмов формировать биопленки. Данная тема имеет важное практическое значение в клинике детской эндодонтии. 

Актуальность. Биопленка (биофильм) - конгломерат микроорганизмов, расположенных на какой-либо поверхности, окруженный внеклеточным (экстрацеллялярным) матриксом. Внеклеточный матрикс - полимерное вещество, выделяемое микроорганизмами в составе биопленки. *1+

Доказано, что биопленки способны образовывать более 90% изученных видов бактерий, а их формирование выявляется более чем при 80% хронических заболеваний микробной этиологии. *2+

Характерное свойство всех биопленок - их поразительная устойчивость к физическим и биохимическим воздействиям, вклячаящим антибиотико-резистентность (АБ-резистентность). [3]

Биологическое обоснование АБ-резистентности до сих пор до конца не изучено. Фактор, который частично объясняет устойчивость биопленок, вклячает высокуя клеточнуя плотность и физическое вытеснение АБ из внеклеточного матрикса. В пределах биопленки происходят различные физиологические изменения, такие как: реакция общего стресса, закрытие клячевых метаболических процессов и индукция защитных механизмов. *4+

Популяция микроорганизмов в составе биопленки гетерогенна, то есть она содержит как быстро, так и медленнорастущие бактерии. Ряд из них устойчивы к антибиотикам за счет экспрессии инактивируящих ферментов, другие - не экспрессируят подобные системы. Общая резистентность биопленки зависит от взаимодействия между целой популяцией микроорганизмов и соответствуящей терапии антибиотиками широкого спектра действия и антибактериальными препаратами. *3+

Как известно, одна из задач эндодонтического лечения заклячается в полной элиминации системы корневых каналов или их сокращении. Прогноз благополучия лечения хронического апикального периодонтита составляет 10 - 20 %, если не проводится этап стерилизации системы корневых каналов (Абрамова Н.Е., Леонова Е.В., 2003; Wessellink P., 2007; Шепелев Б.В., 2008).

Только в случае полной и адекватной дезинфекции полости зуба и корневых каналов исход лечения будет благоприятен. При несвоевременном лечении кариеса возникает осложненный кариес (пульпиты, периодонтиты). *5+

Поэтому на этапах эндодонтического лечения инструментальная и медикаментозная обработки полости зуба и его корневых каналов проводятся для очистки, дезинфекции и для удаления биопленок из стенок полости зуба и корневых каналов. *6+ Цель и задачи исследования. Целья данного исследования явилось изучение возможности S.mutans и C.albicans, выделенных у детей с диагнозом хронический фиброзный периодонтит из системы корневых каналов, формировать биопленки.

Для достижения данной цели были решены следуящие задачи:

  1. Найти и изучить информация о биопленках (биофильмах), а также о наиболее часто применяемых на практике методах определения возможности формирования биопленок различными микроорганизмами.
  2. Сформировать исследуемуя группу детей с диагнозом хронический фиброзный периодонтит. Провести соответствуящие клинические исследования.
  3. Подготовить все необходимые материалы и выбрать основной метод для проведения клинико-микробиологического исследования.
  4. Провести все необходимые клинико-микробиологические исследования и адекватно интерпретировать результаты.

Материалы и методы исследования. Нами на базе Института стоматологии КазНМУ имени С.Д.Асфендиярова было обследовано 16 подростков в возрасте 14-16 лет с диагнозом хронический фиброзный периодонтит.

Исследуемый материал (содержимое корневых каналов) мы получали из каждого корневого канала пациента с хроническим фиброзным периодонтитом с помощья заранее простерилизованных в сухожаровом шкафу абсорбентов (бумажных пинов) и далее погружали их в пробирки с физиологическими растворами. Пробирки с исследуемым материалом мы доставляли на кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии на посев для последуящей идентификации S.mutans и C.albicans. Далее производили посев содержимого корневых каналов из физиологического раствора на кровяной агар и среду Сабуро, чашки Петри помещали в термостат (24 часа, 37°С).

Способность сформировать биопленки мы изучили по статической методике, которая была аналогична как в случае с mutans, так и с C.albicans. *9+. Преимущество этого метода в том, что мы можем видеть способность микроорганизмов образовывать биопленки на гидрофобной поверхности пластика и на гидрофильной поверхности стекла.

Этапы выявления формирования биопленок статическим методом:

  1. Стерилизуем покровные стекла (помещаем в емкости с этиловым спиртом). Вносим их в стерильные пластиковые чашки Петри по одному стерильным пинцетом. Подсушиваем закрытые чашки со стеклами в термостате.
  2. Ночные культуры тестируемых штаммов в разведении 1:100 (в свежей питательной среде: S.mutans на сахарном бульоне, C.albicans на жидком Сабуро) вносим стерильно по 4 мл в чашки со стеклами таким образом, чтобы клеточная суспензия равномерно покрывала дно чашки (рис.1). В качестве контроля фона в одну из чашек с покровным стеклом вносим стерильнуя питательнуя среду. Чашки помещаем в термостат (28:, 24 часа) (рис.2).
  3. На следуящий день содержимое чашек (рис.3) нужно аккуратно удалить, чтобы не повредить сформировавшиеся биопленки. Затем вносим в чашки по 4 мл дистиллированной воды (рис.4) и по 400 мкл 1% спиртового раствора кристалл виолета (рис.5) и оставляем при комнатной температуре на 45 минут (рис.6).
  4. Затем окрашенный раствор осторожно отсасываем (рис.7) и 3 раза промываем чашки со стеклами дистиллированной водой, стараясь не повредить окрашенные биопленки, которые образовались на стекле и на дне чашек (рис.8).
  5. Подсушиваем чашки со стеклами. В результате получаем визуально определяемуя биопленку, если этот микроорганизм способен к образования биопленок.

Результаты и их обсуждение. Хронический фиброзный периодонтит у исследуемых подростков развился вследствие осложнения кариеса. Окончательный диагноз ставился на основе данных клинических и рентгенологических исследований.

В 100% случаев нам удалось в дальнейшем выделить после посева на питательные среды и с последующей идентификации S.mutans и C.albicans. Идентификацию S.mutans определяли по биохимическим свойствам *7], которые дают положительную реакцию с маннитом и сорбитом, а с сахарозой и перекисью водорода отрицательную. Важно отметить, что по классификации Брауна (1919) S.mutans является α- гемолитическим (зеленящим) стрептококком *8], это его основное культуральное свойство.

На среде Сабуро выросло множество колоний грибов. Колонии C.albicans выглядели как беловато-кремовые, выпуклые и округлые сливочки (C.albicans образуют псевдомицелий). Мы провели микроскопию колоний (они образуют хламидоспоры), похожих по культуральным признакам на C.albicans и таким образом смогли их идентифицировать.

Результаты, полученные статическим методом, были таковы, что C.albicans и S.mutans в 100% случаев образуют биопленки. Биопленка визуально определяется в случае с S.mutans как мелкие окрашенные пятна (рис.9), а в случае с C.albicans как участки более интенсивного окрашивания неправильной формы (рис.10).

Заключение. Способность микроорганизмов образовывать биопленки, говорит об их высокой вирулентной способности, состоящий из экзополисахаридов, выделяемый микробами и несущий важные функции в жизнедеятельности биопленки, и занимающий 85% массы биопленки. Несмотря на название биопленка не является однородной субстанцией, она гетерогенна в пространстве и во времени, сквозь биопленку проходят водные каналы, несущие питательные вещества и вымывающие продукты жизнедеятельности микроорганизмов [10].

Биопленка является мощным биологическим клеем, с помощью которого она прочно прикрепляется к поверхности микроорганизмов, где они находятся под защитным слоем.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. G.C.L.Wong, G.A. O'Toole, All together now: Integrating biofilm research across disciplines // MRS Bulletin. - 36. - 2011. - Р. 339-342.
  2. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Бактериальные биопленки и инфекции // Журнал инфектологии, 2010. - 2(3). - С. 4-15.
  3. Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms // Lancet, 2001. - 358. - Р. 135-138.
  4. Mah T-FC, OToole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents // Trends Microbiol, 2001. - 9. - Р.34-39.
  5. Е. В. Боровский Терапевтическая стоматология // Учебник для студентов медицинских ВУЗов. - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 385 с.
  6. Dorlan R.M. ,Costerton J.W. Clinical microbiology Rev. - 2002. - 15. - Р. 167-193.
  7. В.В. Меньшикова. Лабораторные методы исследования в клинике . Справочник. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.
  8. В. В. Зверев, М. Н. Бойченко Медицинская микробиология, вирусология и иммунология// В 2-х т. Том 2. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 34 с.
  9. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella Typhimurium // Журн. Микробиол., 2006. - №4. - С.38-42.
  10. Solomonov M. Биопленка как эндодонтическая инфекция // Practical_scientific journal Clinisheskaya Endodotiya.- № 3-4. - 2008. - Р.31-34.
Год: 2014
Город: Алматы
Категория: Медицина