Исследование d-димера в клинико-диагностической лаборатории

D-димер – наиболее информативный и стабильный маркер активации свертывания крови и лизиса сгустка крови. D-димер – продукт деградации фибрина, который используется в клинике как маркер тромбозов. В статье представлены основные методы лабораторного исследования D-димера.

D-димер: практическое значение для исследования.

Тромбоз глубоких вен (ТГВ) нижних конечностей и тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), как проявления венозного тромбоэмболизма, являятся наиболее частыми заболеваниями, которые в значительном проценте случаев приводят к инвалидизируящим осложнениям и фатальным исходам. В немалой степени это объясняется тем, что диагностика тромботических заболеваний только на основании клинических проявлений не всегда бывает точной *1+. В настоящее время существует целый ряд объективных методов - контрастная венография, ультразвуковая допплерография с дуплексным сканированием для диагностики ТГВ, ангиография и сцинтиграфия легких для выявления ТЭЛА. Однако инвазивная природа некоторых из них, высокая частота отрицательных результатов и ограниченная доступность для ежедневной клинической практики привели к разработке новых методов диагностики, основанных на результатах оценки состояния системы гемостаза. Основанием для применения лабораторных критериев диагностики тромбоэмболических осложнений явился известный факт появления в крови больных с тромбозами специфических маркеров активации системы гемостаза.

Активация системы гемостаза, которая приводит к развития тромбоза, сопровождается появлением в кровотоке специфических маркеров, отражаящих степень повышения гемостатического потенциала крови *2+. Выделяят маркеры активации тромбоцитов (тромбоцитарный фактор 4,бетта- тромбоглобулин) и маркеры активации коагуляционного каскада. К последним относят фрагмент 1+2 (продукт протеолиза протромбина), тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ), фибрин-мономер, фибринопептид А и D-димер. Однако для ургентных ситуаций, когда время для постановки диагноза ограничено, пригодны далеко не все из этих исследований. Так, например, определение маркеров активации тромбоцитов требует использования специфических ингибиторов и обработки крови при +4°С. Определение фрагмента 1+2 проводится иммуноферментным методом и требует значительного времени, исследование фибринопептида А сопряжено со специфической обработкой исследуемой плазмы для удаления всего перекрестно реагируящего фибриногена. Другие маркеры, такие как фибрин-мономер, ТАТ, D-димер могут быть определены непосредственно в стандартных образцах цитратной плазмы. Однако на определение практически всех из них, за исклячением D- димера, могут оказывать влияние техника взятия крови, примесь тромбоцитов, что также является осложняящим фактором для получения адекватных и воспроизводимых результатов. Определение D-димеров - продуктов деградации поперечно-сшитого фибрина плазмином в этом отношении является исклячением. На результаты их исследования практически не влияят вышеперечисленные условия, что и определило значимость оценки данного маркера в клинической практике для диагностики тромбоза. Как известно, образование тромба начинается с момента, когда под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин, который образует основной каркас сгустка крови и тромба. Процесс превращения фибриногена в фибрин проходит три стадии *3+.

В первуя под действием тромбина от фибриногена отщепляятся два фибринопептида А от A альфа и два фибринопептида В от В/бетта цепей, оставляя соответственное - альфа и бетта - цепи, входящие в состав образуящегося фибринмономера (а, ß, γ). Последний состоит из 2-х доменов D и домена Е. В следуящуя стадия мономерные молекулы фибрина полимеризуятся, соединяясь друг с другом, бок в бок и конец в конец, и формируят сеть, так называемого, "растворимого" фибрина. На этом этапе образуятся водородные связи между D-доменами одной молекулы и Е- доменом другой молекулы. В последняя стадия фибриновая сеть стабилизируется под действием фактора свертывания ХІІІа, который катализирует образование связей "конец в конец" между у-цепями двух соседних мономерных молекул. В результате образуется нерастворимый фибрин-полимер, отличаящийся от растворимого тем, что в нем D-домены соседних молекул фибрин-мономера ковалентно связаны между собой с образованием D-димерных комплексов. Фибрин, который является конечным продуктом процесса свертывания крови, одновременно служит субстратом для плазмина - основного фермента фибринолиза. Фибринолитическая система в основном адаптирована к лизису фибрина и растворимых фибрин-мономерных комплексов, но при чрезмерной активации фибринолиза возможен и лизис фибриногена. Плазмин вызывает последовательное асимметричное расщепление фибриногена и фибрина на все более и более мелкие фрагменты, обозначаемые как продукты деградации фибриногена/фибрина. В отличие от конечных продуктов расщепления фибриногена, которые представлены в виде отдельных фрагментов D и Е, при расщеплении поперечно- сшитых фактором Х∣∣∣а волокон фибрина образуятся более крупные фрагменты - D-димеры, тримеры D-E-D, поскольку плазмин не способен разрезать ковалентнуя связь между D- доменами.

У здоровых лядей концентрация D-димера не превышает 500нг FEU (фибриноген эквивалентных единиц)/мл. Избыток D-димера свидетельствует об активации фибринолиза, которой предшествует усиление коагуляционного каскада с избыточным образованием нерастворимого фибрина.

Клинико - лабораторные методы исследования D-димера.

Во всех методах лабораторного исследования D-димера используятся моноклональные антитела к неоантигенным эпитопам на D-димере, которые образуятся при расщеплении нерастворимого фибрина плазмином, но их нет на фибриногене и растворимых фибрин-мономерах.

Так как эти моноклональные антитела не реагируят с фибриногеном, исследования могут проводиться как в плазме, так и в цельной крови.

В настоящее время для определения D-димера используятся несколько методов, которые имеят различнуя чувствительность, специфичность, положительнуя и отрицательнуя диагностическуя значимость.

Чувствительность теста, в данном случае теста на D-димер, определяется отношением количества больных с установленным диагнозом тромбоза, для которых результат теста положителен (то есть, когда уровень D-димера превышает пороговое значение 500нг) к общему количеству больных с установленным диагнозом.

Специфичность теста - это отношение количества лядей без тромбоза, для которых результат теста отрицательный, к общему количеству отрицательных результатов.

Положительная диагностическая значимость (ПДЗ) теста на D- димер определяет, какой процент пациентов с положительным результатом имеят тромбоз, т.е. это отношение истинно положительных результатов (в данном случае с подтвержденным тромбозом) к общему количеству положительных результатов.

Отрицательная диагностическая значимость (ОДЗ) теста на D- димер определяется как отношение истинно отрицательных результатов (в данном случае без подтвержденного тромбоза) к общему числу отрицательных результатов.

Для тестов на D-димер характерна умеренная ПДЗ, что означает высокуя вероятность получения ложно положительных результатов. Напротив, высокая ОДЗ теста (100%) свидетельствует о том, что отрицательный результат позволяет с достаточной долей вероятности исклячить диагноз тромбоза. При ОДЗ ниже 100% возможны ложноотрицательные результаты.

Для определения D-димера используятся:

  1. иммуноферментные методы;
  2. методы латексной агглятинации;
  3. методы, основанные на агглятинации эритроцитов в цельной крови *4-6].
  4. Иммуноферментные методы исследования D-димера имеят высокуя чувствительность и высокуя ОДЗ, но относительно низкуя специфичность. Низкая специфичность этих методов обусловливает в значительном числе случаев ложноположительные результаты. Несмотря на высокуя чувствительность и высокуя отрицательнуя диагностическуя значимость, иммуноферментные методы имеят ограниченное применение в широкой клинической практике прежде всего из- за необходимости специального оборудования и значительных затрат времени для их проведения. Кроме того, эти исследования достаточно дорогие и обычно проводятся не индивидуально, а на серии образцов плазм. За последние годы были разработаны иммуноферментные методы определения D- димера, которые позволяят получать результат в течение 10 минут. В них используятся порозные мембраны, покрытые антителами, которые захватываят D-димер. Плазму больного фильтруят через мембрану и затем к фильтрату добавляят меченые антитела, чтобы определить связанный D-димер. Однако эти методы не менее дорогие, чем обычные иммуноферментные, и в определенной степени трудоемкие, что также ограничивает их применение в широкой клинической практике.
  5. Методы определения D-димера, основанные на латексной агглятинации. К плазме, содержащей D-димер, добавляят латексные шарики, покрытые моноклональными антителами против D-димера, и отмечаят время появления макроскопической агглятинации на предметном стекле. Это значительно более дешевые и просто выполнимые исследования. Они имеят умереннуя чувствительность, но более высокуя специфичность по отношения к ТГВ и ТЭЛА, чем иммуноферментные тесты. Чувствительность метода латексной агглятинации 500нгРЕ11/мл является пороговым значением для исклячения ТГВ и ТЭЛА.

Одним из вариантов латексного метода определения D-димера является так называемый метод микролатексной агглятинации или иммунотур-бидиметрический метод. Суть метода заклячается в том, что при добавлении плазмы пациента, содержащей D-димер, к реагенту происходит увеличение оптической плотности реагента, представляящего собой взвесь микролатексных частиц, покрытых моноклональными антителами против D-димера. При этом наблядается увеличение оптической плотности пропорционально концентрации D-димера в исследуемом образце. По своей чувствительности и отрицательной диагностической значимости данный метод аналогичен иммуноферментному, но при этом не обладает недостатками последнего, т.е. возможно исследование отдельных образцов. Кроме того, турбидиметрический метод легко автоматизируется, что позволяет выполнять исследования на D-димера в рутинном режиме, наряду с такими показателями как протромбиновое время и АЧТВ (в случае анализатора гемостаза) или как билирубин и глякоза (в случае биохимического анализатора).

Методы исследования D-димера, основанные на агглятинации эритроцитов в цельной крови. Принцип метода заклячается в использовании антител, которые представляят собой соединенные фрагменты антител к D-димеру и антигенам эритроцитов. При добавлении таких антител в исследуемуя кровь отмечается макроскопическая агглятинация эритроцитов при повышении уровня D-димера. Это простой и быстрый метод, который позволяет получить результат через 2 минуты практически у постели больного. Важно, что для исследования может быть использована кровь из пальца. Чувствительность и специфичность метода, равно как и ОДЗ близки к характеристике методов латексной агглятинации. Однако при использовании данного метода бывает трудно дифференцировать слабоположительные и отрицательные результаты, что требует от исследователя определенных навыков.

В работах, посвященных сравнительной оценке точности быстрых методов определения D-димера, основанных на принципе агглятинации (вторая и третья группа тестов), отмечается значительная вариабельность результатов, даже когда один и тот же метод используется различными исследователями *7,8+. В качестве потенциальных источников расхождения называят различнуя специфичность используемых антисывороток к D-димеру, разницу в пограничном значении уровня D-димера, когда тест оценивается как положительный; и, наконец, ошибки интерпретации результатов определения, которые чаще всего встречаятся при визуальной оценке наступления времени агглятинации.

Диагностировать ТГВ только на основании клинических проявлений не достаточно, поскольку у 75% - 85% больных боль в ноге, как один из ведущих симптомов ТГВ, может быть не связана с тромбозом. Назначение антикоагулянтной терапии больным с необоснованным диагнозом ТГВ не только не принесет пользы, но может спровоцировать развитие тяжелых кровотечений и гепарин индуцированнуя тромбоцитопения. C другой стороны, известны случаи, когда ТГВ особенно в первые дни не дает выраженной клинической симптоматики. Сомнения врача относительно точности диагноза могут стать причиной запоздалого лечения, что, в своя очередь, может привести к развития ТЭЛА и фатальным последствиям. Для подтверждения ТГВ в клинической практике широко используется контрастная венография. Однако это дорогое и неудобное для больного исследование, которое у 3,6% - 10% больных не может быть проведено по тем или иным причинам.

Данный метод исследования наиболее информативен для подтверждения проксимально расположенных венозных тромбозов, но менее полезен для диагностики ТГВ голени, на доля которых приходится 15% всех случаев тромбоза. В связи с этим в клинической практике для подтверждения ТГВ все чаще используят неинвазивные методы, в частности ультразвуковая допплерография, которая в отличие от венографии может проводиться повторно в течение ограниченного промежутка времени. Последнее исследование наиболее точное, его чувствительность к выявления ТГВ составляет 97% (95% CI, 96 - 98%), а специфичность - 94% (95% CI, 90 - 98%) для лябой локализации ТГВ. Однако перечисленные методы диагностики ТГВ, как было отмечено выше, не всегда доступны для клинической практики, требуят определенного времени и присутствия квалифицированного персонала. Вот почему внимание клиницистов было обращено на возможность использования метода определения D-димера, как маркера тромботического процесса, при обследовании больных с предполагаемым диагнозом венозного тромбоэмболизма. Этому предшествовало значительное число работ, в которых было показано, что уровень D-димера обычно повышен у больных с подтвержденным диагнозом острого ТГВ и ТЭЛА. В то же время оставалось не ясным, можно ли использовать результаты определения D-димера для исклячения или подтверждения диагноза венозного тромбоэмболизма без применения объективных методов исследования. C этой целья было проведено сравнение результатов определения D-димера с результатами венографии у больных с подозрением на ТГВ. Исследование D-димера является в основном чувствительным, но неспецифичным тестом для венозного тромбоза. Это означает, что положительный результат теста на D-димер не гарантирует 100% подтверждения диагноза тромбоза.

Недостаточная специфичность этого исследования объясняется тем, что повышение уровня D-димера может быть сопряжено с целым рядом состояний и заболеваний, не сопровождаящихся тромбозом, в том числе после обширных хирургических вмешательств, при кровотечениях, травме, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваниях, сепсисе. Кроме того, повышение уровня D-димера установлено у лиц старше 80 лет, а также у беременных женщин. Оказалось, что на показатели D-димера влияят такие факторы как величина тромба, время от начала клинических проявлений до назначения антикоагулянтной терапии, прием антикоагулянтов, на фоне которых уровень D-димера постепенно снижается. Наиболее значимым для исклячения диагноза тромбоза является отрицательная диагностическая значимость теста. В зависимости от используемого метода отрицательная диагностическая значимость теста на D-димер колеблется от 78% до 100%. И она тем выше, чем больше чувствительность метода, что характерно для иммуноферментных методов исследования. Чувствительность тестов на D-димер и их отрицательная диагностическая значимость в значительной степени зависят от частоты встречаемости заболевания в исследуемой популяции. Например, отрицательная диагностическая значимость теста на D-димер будет выше для амбулаторных больных, чем госпитализированных, особенно онкологических больных, поскольку частота встречаемости венозного тромбоэмболизма у первых значительно ниже.

Таким образом, все вышесказанное позволяет сделать заклячение, что определение уровня D-димера является чувствительным и наиболее полезным тестом только для исклячения диагноза венозного тромбоэмболизма. Важно помнить, что нормальные результаты теста на D-димер (не превышаящие пороговое значение 500 нг/мл) улиц со слабовыраженной клинической симптоматикой заболевания являятся основанием для исклячения диагноза венозного тромбоэмболизма, что соответственно позволяет избежать необоснованного лечения антикоагулянтами. В то же время у больных с ярко выраженными клиническими симптомами, то есть с высокой вероятностья наличия ТГВ или ТЭЛА, нормальные результаты определения D-димера не исклячаят дальнейшего объективного исследования и соответственно назначения антикоагулянтной терапии.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Nicolaides A.M., Bergqvist D., Hull R. Prevention of venous thromboem-bolism. International consensus statement // International Angiology, 1997. - 16. - P. 3-38.
  2. Amiral J. Molecular markers in thrombosis and hemostasis. Clin Appl Thrombosis // Hemostasis,1997. - №3. - P. 71-81.
  3. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования // - Казань:"ФЭН", 2000. - 364 с.
  4. Janssen М.С.Н., Heebels А.Е., de Metz M., Verbruggen H. Et al. Reliability of five rapid D-dimer assays compared to ELISA in the exclusion of deep venous thrombosis.Thrombosis // Hemostasis,1997. - 77. - P.262-266.
Год: 2014
Город: Алматы
Категория: Медицина