Оценке эффективности диетотерапии у детей раннего возраста с атопическим дерматитом

Оценить динамику растворимых маркеров апоптоза у детей раннего возраста с атопическим дерматитом для уточнения механизмов иммунопатогенеза и оптимизации диетотерапии.

Материалы и методы: под наблядением находилось 66 детеи в возрасте от 1.5 до 12 мес. с атопическим дерматитом (47 мальчиков и 19 девочек) на искусственном вскармливании. При аллергологическом обследовании у всех детеи была выявлена сенсибилизация к белку коровьего молока. Наличие аллергенспецифических IgG и IgE антител к белку коровьего молока, его фракциям и белку козьего молока явилось основанием для вклячения детеи в первуя группу детеи, которая получала гидролизаты в качестве диетотерапии (27 детеи), а 39 детеи второи группы - у которых не было выявлено сенсибилизации к белку козьего молока, получали смеси на его основе. Содержание растворимых маркеров апотоза (sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5) в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом (ELISA).

Результаты: Полученные результаты свидетельсвовали об активация сигнальных систем апоптоза у детеи с атопическим дерматитом (АтД) за счет повышения уровнеи sFas-L и sCD153. Содержание каспаз-8 и -9 было достоверно ниже, чем в контрольнои группе, что отражало нарушение в элиминации измененных иммунокомпетентных клеток. Концентрации аннексина-5 были значительно снижены у детеи с АтД по сравнения с контрольнои группои. Оценивая динамику исследованных показателеи у детеи с АтД при проведении диетотерапии, отмечено статистически достоверное повышение уровня каспазы-9 в обеих группах. Уровень каспазы-8 повышался только в группе детеи использовавших смеси на основе козьего молока. Статистически значимых различии содержания sFas-L, sCD153 и аннексина-5 на фоне диетотерапии не было выявлено в обеих группах.

Заключение: Полученные данные свидетельствовали об участии sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5 в реализации аллергическом воспаления у детеи раннего возраста с АтД. Диетотерапия с использованием смесеи на основе козьего молка способствовала более физиологичному восстановления эффекторного звена апоптоза.

Согласно современным представлениям апоптоз - это процесс, возникаящии в клетке в результате внутреннего или внешнего сигнала определеннои интенсивности и развиваящиися по типичнои для даннои клетки программе *1+. В процессе апоптоза сохраняется целостность клеточных мембран и внутриклеточного содержимого, отсутствуят повреждение тканеи и леикоцитарная инфильтрация. В результате апоптоза происходит физиологическая смена клеточных поколении во всех тканях организма, в том числе и в иммуннои системе, благодаря чему обеспечивается физиологическое равновесие гомеостаза *2+.

Экспериментальными работами последних лет доказано, что активация апоптоза может происходить двумя основными путями: рецептор-опосредованным, при котором индуктором апоптотических изменении выступает комплекс Fas/Fas-L и др., и митохондриальным, за счет высвобождения цитохромома С и других апоптотических белков - регуляторов митохондриальных событии *3+. При сигналинге опосредованном Fas/Fas-L в результате цепочки взаимодеиствия «лиганд-рецептор-адаптер- эффектор» формируятся агрегаты, в которых происходит активация каспазы-8 *4+. При высвобождении цитохромома С, белка Apaf-1 и митохондриальных белков активируется каспаза- 9. В дальнеишем каспазы -8 и -9 воздеиствуят на эффекторные каспазы -3, -6 и -7, что приводит к протеолитическому расщепления белков клетки *5+. Таким образом, каспаза-8 выступает маркером инициации эффекторного звена апоптоза при рецепторном сигналинге, а каспаза-9 - при митохондриальном *6+. Следует отметить, что рецепторныи и митохондриальныи пути взаимодеиствуят и взаимно регулируятся *7+. Поэтому в настоящее время процессы апоптоза оцениваятся по белкам в зависимости от их преимущественного участия либо во внешнем (рецепторном), либо во внутреннем (митохондральном) пути активации *8+.

Доказано, что помимо CD120а, CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2 тригерром апоптоза может выступать белок CD153, также являящиися представителем суперсемеиства TNF, и экспрессируящиися преимущественно на активированных Т- , В- клетках и моноцитах *9+. Его растворимая форма (sCD153) c высоким аффинитетом связывается с рецептором CD30, находящимся на клеточнои мембране, однако конкретные механизмы приводящие к программируемои клеточнои гибели с участием данного рецептора до настоящего времени остаятся малоизученными.

В настоящее время установлено, что биологическая роль аннексина-5 при апоптозе неоднозначна. Экспериментальными работами показано, что аннексин-5 попадает во внеклеточное пространство в результате гибели клеток, при этом отсутствует спецефичность его вотношении апоптоза. В терминальных стадиях апоптоза он связывается с белковыми структурами на внешнеи стороне плазматическои мембраны, ингибируя провоспалительнуя активность клеток, что проявляется повышенными концентрации этого показателя в сыворотке крови *10+.

Внедрение в клиническуя практику новых методов исследования позволило установить участие апоптоза в патогенезе различных заболевании *11+. Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток в патогенезе аллергических болезнеи проводилось с целья определения особенностеи его функционирования в реализации аллергического воспаления. В работах последних лет выявлена устоичивость Т-лимфоцитов к апопотозу как в фазе инициации, так и в эффекторнои стадии у детеи с атопическои бронхиальнои астмои *12+. Однако, эти данные носят фрагментарныи характер, подобные исследования у детеи раннего возраста при других видах аллергопатологии не проводились. Тем не менее в экспериментальных работах было установлено, что элиминация аллергенспецифических эффекторных CD8+ T-клеток за счет апоптоза не приводила к развития аллергического воспаления кожи *13+ Поэтому раскрытие роли апоптоза в механизмах реализации аллергического воспаления представляется важным для профилактики и эффективнои терапии, в том числе и диетотерапии у детеи раннего возраста с АтД.

Цель работы: оценить динамику растворимых маркеров апоптоза при диетотерапии у детеи раннего возраста с атопическим дерматитом.

Материалы и методы: в соответствие с целья и задачами работы проведено исследование растворимых маркеров апоптоза у 66 больных раннего возраста с АтД находившихся на искусственном вскармливании. Возраст обследованных детеи был от 1,5 до 12 месяцев. Дети от 1,5 до 6 месяцев составили 35 человек (53%) от общего числа детеи, дети от 1 до12 месяцев - 31 ребенок (47%). В группе детеи от 1,5 до 6 месяцев преобладали мальчики 71,5 % (25 детеи). Среди детеи от полугода до года 53,3 % составили девочки (16 детеи) и 46,7 % мальчики (22 детеи). Диагноз атопическии дерматит ставился на основании совокупности диагностических критериев, сформулированных на международных согласительных документах *14+. Для оценки степени тяжести атопического дерматита использовалась шкала SCORAD (Severity Scoring of Atopic Dermatitis) *15+. Аллергологическое исследование вклоячало количественное определение аллергенспецифических IgE и IgG антител с помощья иммуноферментного анализа (ИФА) к белку коровьего молока (БКМ), казеину, ɑ-лактальбумину (ɑ-ЛА), ß-лактглобулину (ß-ЛГ) и белку козьего молока в сыворотке крови. Применялись коммерческие тест-системы Allergopharma (Германия).

Содержание sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 выявлялось с помощья коммерческих наборов для ИФА Bender MedSystems (Австрия), уровень аннексина-5 с помощья коммерческих наборов Biosource (BioSource International Inc, Бельгия). Изучение концентрации sFas-L и sCD153 позволяло охарактеризовать рецепторныи путь апоптоза, а каспазы -8 и -9 его эффекторное звено. Определение участия аннексина-5 в реакциях апоптоза было обусловлено его регуляторнои ролья. Учет и регистрация результатов проводилась на вертикальном спектрофотометре Sunrise (TECAN, Австрия) с прилагаемым программным обеспечением. Для получения референсных значении растворимых маркеров апоптоза были использованы образцы крови детеи в возрасте от 1.5 мес. до 3-х лет проходивших обследование перед малыми хирургическими операциями (грыжи и т.д.). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом. Обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ SPSS (США) для персонального компьятера. В связи с тем, что центральные тенденции и дисперсии имели нормальное распределение, при анализе определяли средние значения признака (M), стандартные ошибки среднего (m), среднеквадратичные отклонения (σ). Достоверность различии оценивалась с помощья критерия Стьядента (t) для независимых и связанных выборок при значениях вероятности р < 0,05. Различия групп расценивались, как статистически значимые при р < 0,05 или высоко значимые при р < 0,01.

Дизаин исследования: Исследование являлось открытым, проспективным. Объектом исследования были дети раннего возраста страдаящие АтД, жители московского региона. Критериями вклячения в исследование являлись: возраст больного (1 - 12 мес.), нахождение на искусственном вскармливании; критериями исклячения - участие в другом исследовании, декомпенсированная органная патология, наличие иного аллергического заболевания, желание родителеи пациента. Всем пациентам вкляченным в исследование после объективного обследования, проводимого для уточнения диагноза и оценки степени тяжести, исследовались аллергенспецифические IgE и IgG антитела в сыворотке крови к БКМ, казеину, ɑ-ЛА, ß-ЛГ и белку козьего молока с целья выявления причинно-значимого аллергена. Для определения sCD153, каспазы-8, sFas-L, каспазы-9 и аннексина-5 аликвоты этих сывороток были заморожены (минус 20‘С) до момента проведения анализа Диетотерапия обследованным детям назначалась с учетом данных аллергологического исследования аллергенспецифических IgE и IgG антител к белку БКМ) казеину, ɑ-ЛА, ß-ЛГ и белку козьего молока. На фоне диетотерапии детям проводилась медикаментозная терапия блокаторами Н-1 гистаминовых рецепторов и наружная кожная терапия. По результатам аллергологического обследования были сформированы группы наблядения: в первуя группу вошли дети, которые имели сенсибилизация к белку коровьего и козьего молока (n=27) , а во вторуя - дети, у которых не выявлялась сенсибилизация к белку козьего молока (n=39). Детям первои группы в качестве диетотерапии назначались смеси на основе гидролизатов коровьего молока, детям второи группы - смеси на основе козьего молока. Повторное наблядение проводилось на 21 день диетотерапии и вклячало аналогичныи комплекс иммунологических исследовании.

Результаты и обсуждение: Было установлено, что у всех обследованных детеи реализация атопического дерматита была обусловлена высокои степенья сенсибилизации к БКМ и его фракциям - казеину, ɑ-ЛА, ß-ЛГ. Частота изолированного IgE ответа составляла 52% (34 ребенка), а смешанного (IgG и IgE) - 48% (32 ребенка). Изолированныи IgG ответ не выявлялся ни в одном случае наблядения.

В проведенном исследовании об особенностях функционирования апоптоза судили по уровням sFas-L, sCD153, каспаза-8, каспаза-9 и аннексина-5 в сыворотке крови. Использованные показатели позволили создать представление, как о процессах сигналинга, так и эффекторных механизмах апоптоза с учетом степени тяжести АтД у детеи (таблица № 1).

У детеи с легким течением АтД была выявлена лишь тенденция к повышения sFas-L, в то время, как концентрации sCD153 превышали значения контрольнои группы при легкои, среднеи и тяжелои степени АтД (p<0.05). Можно предположить, что процессы сигналинга апоптоза у детеи с АтД при реализации аллергического воспаления активированы. При тяжелом течении АтД показатели sFas-L и sCD153 были максимально повышены по сравнения с данными контрольнои группы (p<0.05). Иная тенденция прослеживалась при изучении каспазы-8, каспазы-9 и аннексина-5. Концентрации каспаз-8, -9 у обследованных детеи были статистически значимо ниже (р<0,05), чем в контрольнои группе. Минимальные значения этих показателеи были зарегистрированы при тяжелом течении атопического дерматита. Учитывая в целом неспецифическуя регулируящуя роль каспаз в поддержке функционального равновесия, выявляемыи дефицит в содержании каспаз -8 и -9, свидетельствует о дисфункции эффекторного звена апоптоза.

Отмечено статистически значимое (р<0,05), снижение концентрации аннексина-5 у детеи с АтД по сравнения с контрольнои группои. Учитывая его способность к ингибирования провоспалительнои активности клетки можно предположить деполяризация иммунного равновесия в сторону аллергического воспаления.

Следовательно процессы апоптоза при развитии АтД имеят свои особенности. С однои стороны активация сигнальных систем значительно повышена, а с другои имеятся косвенные признаки недостаточнои элиминации измененных клеток, что способствует прогрессирования и хронизации аллергического воспалительного процесса.

Оценивая динамику исследованных показателеи у детеи с АтД при проведении диетотерапии отмечено статистически достоверное (p < 0.01) повышение уровня каспазы-9 в обеих группах ( таблица №2). Уровень каспазы-8 повышался только в группе детеи использовавших смеси на основе козьего молока (p < 0.05). Статистически значимых различии содержания sFas-L, sCD153 и аннексина-5 на фоне диетотерапии выявлено не было, хотя имелась тенденция к нормализации исследуемых показателеи. Таким образом элиминация причинно значимого аллергена у детеи с АтД при проведении диетотерапии приводила к активации митохондриального пути апоптоза.

Учитывая тот факт, что при диетотерапии с использованием смесеи на основе козьего молока, как одного из видов диетического продукта происходит увеличение содержания, как каспазы-9, так и каспазы-8, можно предположить, что данныи вид гипоаллергеннои диеты способствует более физиологичному восстановления эффекторного звена апоптоза. Обобщая результаты проведенных исследовании можно заклячить, что изучение маркеров апоптоза важно с точки зрения раскрытия иммунопатогенеза АтД и определения их прогностическои значимости в процессе проведении диетотерапии у детеи раннего возраста.

Таблица 1 - Маркеры апоптоза в сыворотке крови детеи с атопическим дерматитом (нг/мл, M±m)

* p<0.05 по сравнения с контролем

Таблица 2 - Содержание sFas-L, sCD153, каспазы-9, каспазы -8 и аннексина-5 в сыворотке крови у детеи раннего возраста с АтД в процессе
проведения диетотерапии (нг/мл, M±m)

*p < 0.05, и **p < 0.01 по сравнения с показателем до лечения

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Susan Elmore. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. //Toxicol Pathol. - 2007. - V.35(4). - P.495-516.
2. Ream R.M., Sun J., Braciale T.J. Stimulation of naive CD8+T cells by a variant viral epitope induces activation and enhanced apoptosis. //J.Immunol. - 2010. - V.1,184(5). - P.2401-2409.
3. A Eisenberg-Lerner, S Bialik, H-U Simon. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. //Cell Death and Differentiation. - 2009. - V.16. - P.966-975.
4. Janni T.S., Gobejishvili L., Hote.P.T., Inhibition of methionin adenosyltransferase II induces FasL expression? Fas-DISC formation and caspase -8- dependent apoptopic death in T leukemic cells.//Cel/res. - 2009. - V.19(3). - P.358-369.
5. Kroemer G., Galluzzi L.,Vandenabeele P. Cell Death classificaition of cell death: recommendations of the Nomenclature Commmittee on Cell Death. //Cell Death and Differntiation. - 2009. - V.16. - P.3-11.
6. Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.//Physiol Rev. - 2007. - V. 87(1). - P.99-163.
7. Wilson N.S., Dixit V., Ashkenazi A. Death receptor signal transducers: nodes of coordination in immune signalimg networks.//Nat. Immunol. - 2009. - V.10. - P.348-335.
8. Kurokawa M., Kornbluth S. Caspase and kinases in a death grip. //Cell. - 2009. - V.4,138 (5). - P.838-854.
9. Manzo F., Nebbioso A., Miceli M., et al.TNF - relativ apaptosis-inducing ligand: signaling of a ‘smart' molecule. //Int.J.Biol. - 2009. - V.41(3). P.460-466.
10. Петрищев Н.Н., Васина Л.В., Луговая А.В. Содержание растворимых маркёров апоптоза и циркулируящих аннексин v-связанных апоптических клеток в крови больных острым коронарным синдромом. //Вестн. C-Пб. У-та. - 2008. - Т.11(1). - С.14-23.
11. A Eisenberg-Lerner, S Bialik, H-U Simon. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. //Cell Death and Differentiation. - 2009. - V.16. - P.966-975.
12. Булгакова В.А. Научное обоснование и эффективность иммунопрофилактики и иммунотерапии вируснои и бактериальнои инфекции у детеи с бронхиальнои астмои. Автореферат на соиск. уч. степени докт. мед. наук. М. 2009.
13. Luckey Ulrike; Maurer Marcus; Schmidt Talkea; et al. T cell killing by tolerogenic dendritic cells protects mice from allergy. Journal of clinical investigation. 2011. v.121(10) p.3860-3871.
14. Carsten Flohr. Atopic Dermatitis Diagnostic Criteria and Outcome Measures for Clinical Trials: Still a Mess. Journal of Investigative Dermatology.2011, v.131, p.557-559.
15. Kunz B., Oranje A.P.,Labreze L., et al. Clinical validation and guidelines for the SCORAD index: consensus report of the European Task Force on atopic dermatitis. Dermatology. 1997, v.195, p.10-19.