Другие статьи

Цель нашей работы - изучение аминокислотного и минерального состава травы чертополоха поникшего
2010

Слово «этика» произошло от греческого «ethos», что в переводе означает обычай, нрав. Нравы и обычаи наших предков и составляли их нравственность, общепринятые нормы поведения.
2010

Артериальная гипертензия (АГ) является важнейшей медико-социальной проблемой. У 30% взрослого населения развитых стран мира определяется повышенный уровень артериального давления (АД) и у 12-15 % - наблюдается стойкая артериальная гипертензия
2010

Целью нашего исследования явилось определение эффективности применения препарата «Гинолакт» для лечения ВД у беременных.
2010

Целью нашего исследования явилось изучение эффективности и безопасности препарата лазолван 30мг у амбулаторных больных с ХОБЛ.
2010

Деформирующий остеоартроз (ДОА) в настоящее время является наиболее распространенным дегенеративно-дистрофическим заболеванием суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара.
2010

Целью работы явилась оценка анальгетической эффективности препарата Кетанов (кеторолак трометамин), у хирургических больных в послеоперационном периоде и возможности уменьшения использования наркотических анальгетиков.
2010

Для более объективного подтверждения мембранно-стабилизирующего влияния карбамезапина и ламиктала нами оценивались перекисная и механическая стойкости эритроцитов у больных эпилепсией
2010

Нами было проведено клинико-нейропсихологическое обследование 250 больных с ХИСФ (работающих в фосфорном производстве Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции)
2010


C использованием разработанных алгоритмов и моделей был произведен анализ ситуации в системе здравоохранения биогеохимической провинции. Рассчитаны интегрированные показатели здоровья
2010

Специфические особенности Каратау-Жамбылской биогеохимической провинции связаны с производством фосфорных минеральных удобрений.
2010

Выделение и использование глифосатустойчивых изолятов в биотехнологии деградации глифосата

Синтетические фосфонаты являются основой многих ксенобиотиков и широко распространены среди химических веществ антропогенного происхождения, среди которых: отравляющие вещества, создаваемые в качестве химического оружия - VX, зарин и зоман; гербицид глифосат (фосфонометилглицин); производные этил- и фенилфосфонатов, используемые как инсектициды; алафосфалин и фосфономицин (бисфосфонаты) - антибиотики; циклические эфиры ароматических бисфосфонатов - полимерные добавки; фирол 76 - пламягаситель, полиаминополифосфоновые кислоты - ингибиторы коррозии [1-3].

Однако наиболее широко используемым в мире фосфонатом является гербицид системного действия глифосат, который служит основой более трех десятков препаратов, выпускаемых под разными фирменными названиями и потребляемых в больших количествах (только в США ежегодно применяется около - 22000 тонн этого гербицида, производимого известными фирмами «Монсанто», «Дау Агро Сайэнс» и др., в Украине - 1500 тонн) [цит. по 4]. Использование биологических методов утилизации токсичных фосфонатов, к которым относится и глифосат, отходов их производства и продуктов разложения, рассматривается российскими и зарубежными специалистами в качестве главной альтернативы физическим и химическим методам защиты окружающей среды от токсикантов этого типа [1,2].

В этом плане актуальными являются исследования, проводимые вятскими биотехнологами и микробиологами (ВятГУ и ВятГСХА) и по созданию биологических консорциумов на основе штаммов- биодеструкторов, разработке новых биотехнологических подходовкомплексного использования их для уничтожения ксенобиотиков, в том числе фосфонатов в природных и искусственных средах [5-7].

Практический интерес представляет использование глифосатустойчивых изолятов протеобактерий, выделенных из почвы в местах мест интенсивного использования глифосата, в биотехнологии деградации фосфонометилглицина.

Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка эффективности разложения глифосата почвенными изолятами протеобактерий.

Материалы и методы исследования

Для тестирования чувствительности псевдомонад к глифосату использовали препарат Раундап («Монсанто», США), содержащий 36% глифосата.

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы вновь выделенные изоляты протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes и ранее выделенный изолят P. fluorescens с типичными родовыми и видовыми свойствами, в качестве контролей - ранее описанные штаммы из коллекции биодеструкторов ВятГУ [5,6].

Питательные среды. Для выращивания микроорганизмов использовали плотную питательную среду, содержащую: картофельный крахмал - 1,0%; соевую муку - 3,0%; (NH4)2C4H4O6 - 0,6%; (NH4)2S04 - 0,4%; СаСО3, - 0,8%; К2НРО4 - 0,01%; глюкозы - 2,0%; агара – 2%, воды водопроводной до 100% и жидкую среду того же состава – без агара «соевая среда».

Микробиологические методы.

Количественный анализ содержания глифосата в почве проводили хроматографическим методом, групповой принадлежности почвенных микроорганизмов, получение накопительных и выделение чистых микробных культур проводили микробиологическими методами [8-12].

В качестве посевного материала использовали двухсуточные культуры бактерий, выращенные на плотной среде при температуре 24-28 °С. Культуры, выросшие на плотной среде, смывали физиологическим раствором и разводили до концентрации 1,5·109 бактерий в см3.

В колбы Эрленмейера объемом 500 вносили по 62,5; 250,0 и 1000,0 мкл препарата Раундап (22,5; 90,0 и 360,0 мг глифосата), затем готовой жидкой средой доводили объем рабочей смеси в колбах до 140 см3 и вносили по 10,0 см3 исследуемых посевных культур. Конечная концентрация бактерий в среде при посеве составляла 1,0·10протеобактерий в см3, глифосата -150 и 600 мкг·см-3. Выращивание вели при температуре 24-28 °С на шуттеле со скоростью вращения платформы 250 об/мин. Через 24 ч культивирования проводили определение количества живых бактерий в средах путем высева серийных разведений на плотные среды. Родовую и видовую принадлежность выделяемых получаемых микробных культур проводили с использованием идентификационных тест-систем (наборов) МИКРО-ЛА-ТЕСТ, производства PLIVA – Lachema (Чехия) и прилагаемых к ним Code book [12].

Результаты исследования. Культуры протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes были выделены и идентифицированы при исследовании микробной обсемененности проб почвы, отобранных на участках сельхозугодий в Оричевском и Нововятском районах Кировской области, которые многократно подвергались воздействию глифосата. При каждой обработке методом распыления расход на 100 м2 поля, предназначенного под посев овощных культур и картофеля, в среднем составлял 5 литров водного раствора, содержащего 65-70 мл 36% глифосата.

В августе 2013 г было отобрано четыре группы образцов почвы по 5 проб в каждой: 1 группа – образцы почвы, не обрабатываемой ранее гербицидами (контроль почвы перед обработкой глифосатом); 2 группа - образцы почвы обработанной однократно в июле 2013 гг., с последней обработки до взятия пробы прошел один месяц; 3 группа - образцы почвы обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008-2012 гг.) в весеннелетний период, при этом с последней обработки прошел год; 4 группа - пробы почвы обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008-2012 гг.) в весенне-летний период и дополнительно – однократно в июле 2013 гг., с последней обработки до взятия проб прошел один месяц.

Результаты анализов свидетельствовали, что общее количество микроорганизмов менялось в зависимости от количества обработок гербицидом, так в 1 группе (контрольной) образцов почвы средняя концентрация микроорганизмов составляла 8·105 КОЕ/г, в 2-4 группах 5·102; 9·104; 2·104, соответственно (рис.1).

Рисунок 1 - Содержание общего количества микроорганизмов (log колониеобразующих единиц - log КОЕ) в 1 г проб почвы:

  1. - не подвергавшейся воздействию глифосата (контроль до воздействия гербицидом);
  2. - обработанной однократно в июле 2013 гг., за месяц до отбора и анализа проб;
  3. - подвергавшейся воздействию глифосата 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008-2012 гг.);
  4. - подвергавшейся воздействию фосфонометилглицина 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008-2012 гг.) и 1 раз в 2013 гг., за месяц до отбора и анализа проб

Полученные результаты свидетельствуют, что обработка гербицидом почвы приводит к резкому снижению концентрации микроорганизмов в ней. Через месяц после однократной обработки глифосатом количество микроорганизмов в исследуемых образцах почвы было меньше в 1600 раз в сравнении с контрольными. Через год после многократной (11 раз в течение 5 лет) обработки гербицидом концентрация микроорганизмов в почве в значительной степени восстановилась, но была ниже, чем в контроле примерно в 8,9 раза. В этом случае, по-видимому, сказывалось накопление глифосата и продуктов его разложения в почве. Результаты определения концентрации микроорганизмов в четвертой группе проб показали, что микрофлора почвы, регулярно подвергавшейся обработке глифосатом, стала устойчива к повторным воздействиям гербицида и быстрее восстанавливалась. Об этом свидетельствуют результаты сравнительного анализа через месяц после обработки глифосатом образцов проб почвы многократно подвергавшейся воздействию глифосата в предшествующие годы и первично обработанной глифосатом, среднее содержание микроорганизмов в образцах проб почвы группы 4 было в 50 раз выше, чем в образцах почвы группы 2.

В ходе исследований образцов почвы многократно обработанных глифосатом (12 раз в течение 6 лет) были выделены и идентифицированы по 6 изолятов бактерий видов Pseudomonas alcaligenes и 4изолята Proteus vulgaris, которые наряду с ранее выделенными [5] изолятами P. fluorescens обладали повышенной устойчивостью к токсическому действию глифосата в сравнении с контрольными лабораторными штаммами не контактировавших с гербицидом (табл. 1).

При этом 3 из вновь выделенных 10 изолятов P. alcaligenes и Prvulgaris (30%) были способны к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг/см3 глифосата, 4 изолята (40 %) и 3 изолята (30%) бактерий были способны к росту в жидкой среде, содержащей соответственно 0,1 и 0,025 мкг/см3 фосфонометилглицина.

На основе первичных изолятов, устойчивых к 0,4 мкг·см-3 глифосата, в результате восьми пересевов культур в жидкой соевой среде с возрастающими концентрациями глифосата и отбора наиболее устойчивых клонов, были выделены клоновые культуры Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к и 50, 110 и 250 мкг·см-3 глифосата, соответственно (рис.2).

Как видно из данных, представленных на рис. 2, при равной исходной чувствительности к глифосату нарастание устойчивости к нему у изолята псевдомонад вида fluorescens происходило более интенсивно, чем у изолята вида alcaligenes и вульгарного протея. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата культура P. fluorescens 047/8 повысила уровень устойчивости первичного изолята в 625 раз, в то время как культура P. alcaligenes 5/8 - в 275 раз, культура Pr. vulgaris 3/8 – в 125 раз.

На следующем этапе исследований, представлялось целесообразным оценить возможность использования глубинных культур полученных вариантов в процессах деструкции глифосата в лабораторных условиях глубинного культивирования и при их интродукции в контаминированную данным гербицидом почву.

При глубинном культивировании всех трех исследуемых культур в «соевой среде» без гербицида при посевной концентрации 1,0·108 КОЕ·см- 3 через сутки биомасса составляла (4,9-6,2)·109 КОЕ·см-3 (табл. 1). Внесение в среду 150 мкг·см-3 глифосата сопровождалось снижением исходной концентрации бактерий после засева в случае культур вариантов Pr. vulgaris 3/8 и P. alcaligenes 5/8 до 0,3·106 и 0,4·108 КОЕ·см-3, при этом концентрация глифосата в среде снижалась на 26,7-50,0 %. Культура P. fluorescens 047/8 была способна расти на среде содержащей 150 мкг·см-3 гербицида, при этом она способствовала инактивации за сутки 90% гербицида, хотя концентрация бактерий повысилась за сутки только до 3,8·109 КОЕ·см-3, что в 1,6 раз ниже, чем в среде без глифосата. Следует

отметить, что 6,7 % глифосата в контрольных средах инактивировалось без участия бактерий (табл. 2).

Таблица 2 -Инактивация глифосата в жидкой «соевой среде» при глубинном культивировании псевдомонад.

Микроорганизм

Концентрация глифосата в жидкой среде, мкг·см¯3

Содержание живых бактерий в среде через 24 ч, КОЕ·см¯3

исходная

после культивирования (% от исходной)

P. fluorescens 047/8

0

0

6,2·109

150

15 (10,0)

3,8·109

600

200 (33,3)

0

P. alcaligenes 5/8

0

0

4,9·109

150

75 (50,0)

0,4·108

600

450 (75)

0

Pr. vulgaris 3/8

0

0

5,7·109

150

110 (73,3)

0,3∙106

600

510 (85,0)

0

Контроль (инактивация гербицида в среде без бактериальных культур)

150

140 (93,3)

¯

600

560 (93,3)

-

Далее, был поставлен эксперимент по контаминации образцов стерильной черноземной почвы (рН 6,7) глифосатом из расчета 2400 мкг·см-3 с последующей инокуляцией в нее глубинной культуры P. alcaligenes 5/8, выращенной в «соевой среде» с 150 мкг·см-3 глифосата, до конечной концентрации в почве 1,0·108 КОЕ·см-3. В качестве контроля была использована та же почва без инокуляции микробной культуры. Уже через 5 часов после инокуляции глифосат в почве с внесенной в нее культурой P. alcaligenes 5/8 глифосат не определялся, в то время как в контрольных образцах его содержание в этот период снизилось за счет связываться частицами почвы, действия почвенных солей и других факторов только до 1200 – 1400 мкг·см-3. Следует отметить, что период нормального полураспада глифосата в почве в зависимости от типа почв, как было установлено специалистами US EPA, находится в диапазоне от 3 до 130 дней [13].

Выводы.

  1. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата получены варианты Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к 50, 110 и 250 мкг·см-3 глифосата, что превышает уровни устойчивости первичных изолятов (исходных культур) в 125; 275 и 625 раз, соответственно.
  2. Инокуляция культуры варианта P. alcaligenes 5/8 в концентрации 1,0∙108 КОЕ·см¯3 в стерильные образцы черноземной почвы, содержащей 2400 мкг·см¯3 глифосата, привело к тому, что гербицид в почве не определялся уже через 5 часов, что свидетельствует овозможности создания с использованием данной глифосатрезистентной культуры специальных препаратов для ремедиации загрязненных этим ксенобиотиком почв.

 

Литература

  1. Кононова, С.В. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами / С.В. Кононова, М.А. Несмеянова // Биохимия. – 2002, Т. 67, Вып. 2, № 6. - С.220-233.
  2. Ефременко, Е.Н. Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Е.Н. Ефременко, Н.В. Завьялова, Д.А. Гудков, И.В. Лягин и др. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2010,Т.54, № 4. – С.19-24.
  3. Кузнецова, Е. М. Глифосат: поведение в окружающей среде и уровни остатков / Е. М. Кузнецова, В. Д. Чмиль // Современные проблемы токсикологии. – 2010, №1. -С. 87-95.
  4. Жариков, М.Г. Изучение влияния глифосатсодержащих гербицидов на агроценоз / М.Г. Жариков, Ю.Я. Спиридонов // Агрохимия. - 2008. - № 8. - С. 81 - 89.
  5. Бакулин, В.М. Выделение бактерий рода Pseudomonas из почвы, загрязненной ксенобиотиком фосфонометилглицином / В.М. Бакулин, Е.А. Мартинсон, М.К. Бакулин, Н.С. Мячина, Ю.С. Овсянников// Ветеринарная медицина. 2012, № 1. – С.9-11.
  6. Бакулин, М.К. Интенсификация биодеградации нефти и нефтепродуктов под влиянием перфтордекалина /М.К. Бакулин, // Прикл. биохимия и микробиология. 2004, Т. 40, №3. – С. 317-322.
  7. Бакулин, М.К. Влияние перфтордекалина и карбогала на рост микроорганизмов-нефтедеструкторов в ассоциации с азотобактером на жидкой синтетической среде с нефтью/ М.К. Бакулин, А.Ю.Плетнева, А.С. Грудцына, Л.В. Бакулина // Биотехнология. 2006, №6. – С.44-50.
  8. Evans, C.G.T. Methods in Microbiology // C.G.T. Evans, D. Herbert, D. Tempest // 1970. - P.277-327.
  9. Клисенко, М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Справочник в 2 т // М.А. Клисенко, А.А. Калинина, Г.А. Холькова.// М.: Колос, 1992. Т 1. - 567 с.
  10. Виноградский, С.Н. Микробиология почвы // М.: Изд-во АН СССР, 1952. – 370 с.
  11. Звягинцев, Д.Г. Биололгия почв. / Д.Г. Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова // М.: Изд-во МГУ, 2005. - 445 с.
  12. ЛАХЕМА, Брно, Чешская Республика: diagnostics@lachema.cz,http: //www.lachema.cz.
  13. Pesticide Fact Handbook : US EPA. Noyes Data Corporation. Park Ridge, New Jersey, 1990. - Vol. 2. - P. 301 - 312.

Разделы знаний

Архитектура

Научные статьи по Архитектуре

Биология

Научные статьи по биологии 

Военное дело

Научные статьи по военному делу

Востоковедение

Научные статьи по востоковедению

География

Научные статьи по географии

Журналистика

Научные статьи по журналистике

Инженерное дело

Научные статьи по инженерному делу

Информатика

Научные статьи по информатике

История

Научные статьи по истории, историографии, источниковедению, международным отношениям и пр.

Культурология

Научные статьи по культурологии

Литература

Литература. Литературоведение. Анализ произведений русской, казахской и зарубежной литературы. В данном разделе вы можете найти анализ рассказов Мухтара Ауэзова, описание творческой деятельности Уильяма Шекспира, анализ взглядов исследователей детского фольклора.  

Математика

Научные статьи о математике

Медицина

Научные статьи о медицине Казахстана

Международные отношения

Научные статьи посвященные международным отношениям

Педагогика

Научные статьи по педагогике, воспитанию, образованию

Политика

Научные статьи посвященные политике

Политология

Научные статьи по дисциплине Политология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Психология

В разделе "Психология" вы найдете публикации, статьи и доклады по научной и практической психологии, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. В своих работах авторы делают обзоры теорий различных психологических направлений и школ, описывают результаты исследований, приводят примеры методик и техник диагностики, а также дают свои рекомендации в различных вопросах психологии человека. Этот раздел подойдет для тех, кто интересуется последними исследованиями в области научной психологии. Здесь вы найдете материалы по психологии личности, психологии разивития, социальной и возрастной психологии и другим отраслям психологии.  

Религиоведение

Научные статьи по дисциплине Религиоведение опубликованные в Казахстанских научных журналах

Сельское хозяйство

Научные статьи по дисциплине Сельское хозяйство опубликованные в Казахстанских научных журналах

Социология

Научные статьи по дисциплине Социология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Технические науки

Научные статьи по техническим наукам опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физика

Научные статьи по дисциплине Физика опубликованные в Казахстанских научных журналах

Физическая культура

Научные статьи по дисциплине Физическая культура опубликованные в Казахстанских научных журналах

Филология

Научные статьи по дисциплине Филология опубликованные в Казахстанских научных журналах

Философия

Научные статьи по дисциплине Философия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Химия

Научные статьи по дисциплине Химия опубликованные в Казахстанских научных журналах

Экология

Данный раздел посвящен экологии человека. Здесь вы найдете статьи и доклады об экологических проблемах в Казахстане, охране природы и защите окружающей среды, опубликованные в научных журналах и сборниках статей Казахстана. Авторы рассматривают такие вопросы экологии, как последствия испытаний на Чернобыльском и Семипалатинском полигонах, "зеленая экономика", экологическая безопасность продуктов питания, питьевая вода и природные ресурсы Казахстана. Раздел будет полезен тем, кто интересуется современным состоянием экологии Казахстана, а также последними разработками ученых в данном направлении науки.  

Экономика

Научные статьи по экономике, менеджменту, маркетингу, бухгалтерскому учету, аудиту, оценке недвижимости и пр.

Этнология

Научные статьи по Этнологии опубликованные в Казахстане

Юриспруденция

Раздел посвящен государству и праву, юридической науке, современным проблемам международного права, обзору действующих законов Республики Казахстан Здесь опубликованы статьи из научных журналов и сборников по следующим темам: международное право, государственное право, уголовное право, гражданское право, а также основные тенденции развития национальной правовой системы.