Выделение и использование глифосатустойчивых изолятов в биотехнологии деградации глифосата

Синтетические фосфонаты являются основой многих ксенобиотиков и широко распространены среди химических веществ антропогенного происхождения, среди которых: отравляющие вещества, создаваемые в качестве химического оружия - VX, зарин и зоман; гербицид глифосат (фосфонометилглицин); производные этил- и фенилфосфонатов, используемые как инсектициды; алафосфалин и фосфономицин (бисфосфонаты) - антибиотики; циклические эфиры ароматических бисфосфонатов - полимерные добавки; фирол 76 - пламягаситель, полиаминополифосфоновые кислоты - ингибиторы коррозии [1-3].

Однако наиболее широко используемым в мире фосфонатом является гербицид системного действия глифосат, который служит основой более трех десятков препаратов, выпускаемых под разными фирменными названиями и потребляемых в больших количествах (только в США ежегодно применяется около - 22000 тонн этого гербицида, производимого известными фирмами «Монсанто», «Дау Агро Сайэнс» и др., в Украине - 1500 тонн) [цит. по 4]. Использование биологических методов утилизации токсичных фосфонатов, к которым относится и глифосат, отходов их производства и продуктов разложения, рассматривается российскими и зарубежными специалистами в качестве главной альтернативы физическим и химическим методам защиты окружающей среды от токсикантов этого типа [1,2].

В этом плане актуальными являются исследования, проводимые вятскими биотехнологами и микробиологами (ВятГУ и ВятГСХА) и по созданию биологических консорциумов на основе штаммов- биодеструкторов, разработке новых биотехнологических подходовкомплексного использования их для уничтожения ксенобиотиков, в том числе фосфонатов в природных и искусственных средах [5-7].

Практический интерес представляет использование глифосатустойчивых изолятов протеобактерий, выделенных из почвы в местах мест интенсивного использования глифосата, в биотехнологии деградации фосфонометилглицина.

Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка эффективности разложения глифосата почвенными изолятами протеобактерий.

Материалы и методы исследования

Для тестирования чувствительности псевдомонад к глифосату использовали препарат Раундап («Монсанто», США), содержащий 36% глифосата.

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы вновь выделенные изоляты протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes и ранее выделенный изолят P. fluorescens с типичными родовыми и видовыми свойствами, в качестве контролей - ранее описанные штаммы из коллекции биодеструкторов ВятГУ [5,6].

Питательные среды. Для выращивания микроорганизмов использовали плотную питательную среду, содержащую: картофельный крахмал - 1,0%; соевую муку - 3,0%; (NH₄)₂C₄H₄O₆ - 0,6%; (NH₄)₂S0₄ - 0,4%; СаСО₃, - 0,8%; К₂НРО₄ - 0,01%; глюкозы - 2,0%; агара – 2%, воды водопроводной до 100% и жидкую среду того же состава – без агара «соевая среда».

Микробиологические методы.

Количественный анализ содержания глифосата в почве проводили хроматографическим методом, групповой принадлежности почвенных микроорганизмов, получение накопительных и выделение чистых микробных культур проводили микробиологическими методами [8-12].

В качестве посевного материала использовали двухсуточные культуры бактерий, выращенные на плотной среде при температуре 24-28 °С. Культуры, выросшие на плотной среде, смывали физиологическим раствором и разводили до концентрации 1,5·10⁹ бактерий в см³.

В колбы Эрленмейера объемом 500 вносили по 62,5; 250,0 и 1000,0 мкл препарата Раундап (22,5; 90,0 и 360,0 мг глифосата), затем готовой жидкой средой доводили объем рабочей смеси в колбах до 140 см³ и вносили по 10,0 см³ исследуемых посевных культур. Конечная концентрация бактерий в среде при посеве составляла 1,0·10⁸ протеобактерий в см³, глифосата -150 и 600 мкг·см^-3. Выращивание вели при температуре 24-28 °С на шуттеле со скоростью вращения платформы 250 об/мин. Через 24 ч культивирования проводили определение количества живых бактерий в средах путем высева серийных разведений на плотные среды. Родовую и видовую принадлежность выделяемых получаемых микробных культур проводили с использованием идентификационных тест-систем (наборов) МИКРО-ЛА-ТЕСТ, производства PLIVA – Lachema (Чехия) и прилагаемых к ним Code book [12].

Результаты исследования. Культуры протеобактерий Proteus vulgaris, Pseudomonas alcaligenes были выделены и идентифицированы при исследовании микробной обсемененности проб почвы, отобранных на участках сельхозугодий в Оричевском и Нововятском районах Кировской области, которые многократно подвергались воздействию глифосата. При каждой обработке методом распыления расход на 100 м² поля, предназначенного под посев овощных культур и картофеля, в среднем составлял 5 литров водного раствора, содержащего 65-70 мл 36% глифосата.

В августе 2013 г было отобрано четыре группы образцов почвы по 5 проб в каждой: 1 группа – образцы почвы, не обрабатываемой ранее гербицидами (контроль почвы перед обработкой глифосатом); 2 группа - образцы почвы обработанной однократно в июле 2013 гг., с последней обработки до взятия пробы прошел один месяц; 3 группа - образцы почвы обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008-2012 гг.) в весеннелетний период, при этом с последней обработки прошел год; 4 группа - пробы почвы обработанной 11 раз в предшествующие пять лет (2008-2012 гг.) в весенне-летний период и дополнительно – однократно в июле 2013 гг., с последней обработки до взятия проб прошел один месяц.

Результаты анализов свидетельствовали, что общее количество микроорганизмов менялось в зависимости от количества обработок гербицидом, так в 1 группе (контрольной) образцов почвы средняя концентрация микроорганизмов составляла 8·10⁵ КОЕ/г, в 2-4 группах 5·10²; 9·10⁴; 2·10⁴, соответственно (рис.1).

Рисунок 1 - Содержание общего количества микроорганизмов (log колониеобразующих единиц - log КОЕ) в 1 г проб почвы:

1. - не подвергавшейся воздействию глифосата (контроль до воздействия гербицидом);
2. - обработанной однократно в июле 2013 гг., за месяц до отбора и анализа проб;
3. - подвергавшейся воздействию глифосата 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008-2012 гг.);
4. - подвергавшейся воздействию фосфонометилглицина 11 раз в течение предшествующих пяти лет (2008-2012 гг.) и 1 раз в 2013 гг., за месяц до отбора и анализа проб

Полученные результаты свидетельствуют, что обработка гербицидом почвы приводит к резкому снижению концентрации микроорганизмов в ней. Через месяц после однократной обработки глифосатом количество микроорганизмов в исследуемых образцах почвы было меньше в 1600 раз в сравнении с контрольными. Через год после многократной (11 раз в течение 5 лет) обработки гербицидом концентрация микроорганизмов в почве в значительной степени восстановилась, но была ниже, чем в контроле примерно в 8,9 раза. В этом случае, по-видимому, сказывалось накопление глифосата и продуктов его разложения в почве. Результаты определения концентрации микроорганизмов в четвертой группе проб показали, что микрофлора почвы, регулярно подвергавшейся обработке глифосатом, стала устойчива к повторным воздействиям гербицида и быстрее восстанавливалась. Об этом свидетельствуют результаты сравнительного анализа через месяц после обработки глифосатом образцов проб почвы многократно подвергавшейся воздействию глифосата в предшествующие годы и первично обработанной глифосатом, среднее содержание микроорганизмов в образцах проб почвы группы 4 было в 50 раз выше, чем в образцах почвы группы 2.

В ходе исследований образцов почвы многократно обработанных глифосатом (12 раз в течение 6 лет) были выделены и идентифицированы по 6 изолятов бактерий видов Pseudomonas alcaligenes и 4изолята Proteus vulgaris, которые наряду с ранее выделенными [5] изолятами P. fluorescens обладали повышенной устойчивостью к токсическому действию глифосата в сравнении с контрольными лабораторными штаммами не контактировавших с гербицидом (табл. 1).

При этом 3 из вновь выделенных 10 изолятов P. alcaligenes и Prvulgaris (30%) были способны к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг/см³ глифосата, 4 изолята (40 %) и 3 изолята (30%) бактерий были способны к росту в жидкой среде, содержащей соответственно 0,1 и 0,025 мкг/см³ фосфонометилглицина.

На основе первичных изолятов, устойчивых к 0,4 мкг·см^-3 глифосата, в результате восьми пересевов культур в жидкой соевой среде с возрастающими концентрациями глифосата и отбора наиболее устойчивых клонов, были выделены клоновые культуры Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к и 50, 110 и 250 мкг·см^-3 глифосата, соответственно (рис.2).

Как видно из данных, представленных на рис. 2, при равной исходной чувствительности к глифосату нарастание устойчивости к нему у изолята псевдомонад вида fluorescens происходило более интенсивно, чем у изолята вида alcaligenes и вульгарного протея. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата культура P. fluorescens 047/8 повысила уровень устойчивости первичного изолята в 625 раз, в то время как культура P. alcaligenes 5/8 - в 275 раз, культура Pr. vulgaris 3/8 – в 125 раз.

На следующем этапе исследований, представлялось целесообразным оценить возможность использования глубинных культур полученных вариантов в процессах деструкции глифосата в лабораторных условиях глубинного культивирования и при их интродукции в контаминированную данным гербицидом почву.

При глубинном культивировании всех трех исследуемых культур в «соевой среде» без гербицида при посевной концентрации 1,0·10⁸ КОЕ·см^{- 3} через сутки биомасса составляла (4,9-6,2)·10⁹ КОЕ·см^-3 (табл. 1). Внесение в среду 150 мкг·см^-3 глифосата сопровождалось снижением исходной концентрации бактерий после засева в случае культур вариантов Pr. vulgaris 3/8 и P. alcaligenes 5/8 до 0,3·10⁶ и 0,4·10⁸ КОЕ·см^-3, при этом концентрация глифосата в среде снижалась на 26,7-50,0 %. Культура P. fluorescens 047/8 была способна расти на среде содержащей 150 мкг·см^-3 гербицида, при этом она способствовала инактивации за сутки 90% гербицида, хотя концентрация бактерий повысилась за сутки только до 3,8·10⁹ КОЕ·см^-3, что в 1,6 раз ниже, чем в среде без глифосата. Следует

отметить, что 6,7 % глифосата в контрольных средах инактивировалось без участия бактерий (табл. 2).

Таблица 2 -Инактивация глифосата в жидкой «соевой среде» при глубинном культивировании псевдомонад.

Далее, был поставлен эксперимент по контаминации образцов стерильной черноземной почвы (рН 6,7) глифосатом из расчета 2400 мкг·см^-3 с последующей инокуляцией в нее глубинной культуры P. alcaligenes 5/8, выращенной в «соевой среде» с 150 мкг·см^-3 глифосата, до конечной концентрации в почве 1,0·10⁸ КОЕ·см^-3. В качестве контроля была использована та же почва без инокуляции микробной культуры. Уже через 5 часов после инокуляции глифосат в почве с внесенной в нее культурой P. alcaligenes 5/8 глифосат не определялся, в то время как в контрольных образцах его содержание в этот период снизилось за счет связываться частицами почвы, действия почвенных солей и других факторов только до 1200 – 1400 мкг·см^-3. Следует отметить, что период нормального полураспада глифосата в почве в зависимости от типа почв, как было установлено специалистами US EPA, находится в диапазоне от 3 до 130 дней [13].

Выводы.

1. В результате 8 пассажей на средах с возрастающими концентрациями глифосата получены варианты Pr. vulgaris 3/8, P. alcaligenes5/8 и P. fluorescens 047/8 с резистентностью к 50, 110 и 250 мкг·см^-3 глифосата, что превышает уровни устойчивости первичных изолятов (исходных культур) в 125; 275 и 625 раз, соответственно.
2. Инокуляция культуры варианта P. alcaligenes 5/8 в концентрации 1,0∙10⁸ КОЕ·см¯³ в стерильные образцы черноземной почвы, содержащей 2400 мкг·см¯³ глифосата, привело к тому, что гербицид в почве не определялся уже через 5 часов, что свидетельствует овозможности создания с использованием данной глифосатрезистентной культуры специальных препаратов для ремедиации загрязненных этим ксенобиотиком почв.

Литература

1. Кононова, С.В. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами / С.В. Кононова, М.А. Несмеянова // Биохимия. – 2002, Т. 67, Вып. 2, № 6. - С.220-233.
2. Ефременко, Е.Н. Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Е.Н. Ефременко, Н.В. Завьялова, Д.А. Гудков, И.В. Лягин и др. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2010,Т.54, № 4. – С.19-24.
3. Кузнецова, Е. М. Глифосат: поведение в окружающей среде и уровни остатков / Е. М. Кузнецова, В. Д. Чмиль // Современные проблемы токсикологии. – 2010, №1. -С. 87-95.
4. Жариков, М.Г. Изучение влияния глифосатсодержащих гербицидов на агроценоз / М.Г. Жариков, Ю.Я. Спиридонов // Агрохимия. - 2008. - № 8. - С. 81 - 89.
5. Бакулин, В.М. Выделение бактерий рода Pseudomonas из почвы, загрязненной ксенобиотиком фосфонометилглицином / В.М. Бакулин, Е.А. Мартинсон, М.К. Бакулин, Н.С. Мячина, Ю.С. Овсянников// Ветеринарная медицина. 2012, № 1. – С.9-11.
6. Бакулин, М.К. Интенсификация биодеградации нефти и нефтепродуктов под влиянием перфтордекалина /М.К. Бакулин, // Прикл. биохимия и микробиология. 2004, Т. 40, №3. – С. 317-322.
7. Бакулин, М.К. Влияние перфтордекалина и карбогала на рост микроорганизмов-нефтедеструкторов в ассоциации с азотобактером на жидкой синтетической среде с нефтью/ М.К. Бакулин, А.Ю.Плетнева, А.С. Грудцына, Л.В. Бакулина // Биотехнология. 2006, №6. – С.44-50.
8. Evans, C.G.T. Methods in Microbiology // C.G.T. Evans, D. Herbert, D. Tempest // 1970. - P.277-327.
9. Клисенко, М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Справочник в 2 т // М.А. Клисенко, А.А. Калинина, Г.А. Холькова.// М.: Колос, 1992. Т 1. - 567 с.
10. Виноградский, С.Н. Микробиология почвы // М.: Изд-во АН СССР, 1952. – 370 с.
11. Звягинцев, Д.Г. Биололгия почв. / Д.Г. Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова // М.: Изд-во МГУ, 2005. - 445 с.
12. ЛАХЕМА, Брно, Чешская Республика: diagnostics@lachema.cz,http: //www.lachema.cz.
13. Pesticide Fact Handbook : US EPA. Noyes Data Corporation. Park Ridge, New Jersey, 1990. - Vol. 2. - P. 301 - 312.