АННОТАЦИЯ
В статье рассмотрено влияние сорбентов разных классов на метаболизм L-аргинина, процессы перок- сидного окисления липидов (ПОЛ), состояние антиоксидантных систем (АО) в крови крыс в условиях сочетанной хронической интоксикации нитратом и фторидом натрия. В качестве энтеросорбентов использованы: суспензия нанодисперсного кремнезёма, суспензия лигнина гидролизного, активированный уголь (карболайн). Опыт проведён на 62 белых крысах линии Wistar в течение 30 дней. Хроническая сочетанная интоксикация воспроизводилась путём введения в желудок раствора, содержащего нитрат натрия и фторид натрия из расчёта 500 и 10mγ∕kγ соответственно. Метаболизм L-аргинина оценивали путём определения общей активности NO-синтаз и общей активности аргиназ. Процессы ПОЛ оценивались по спектрофотометрическому определению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой и их приростом после 1,5-часовой инкубации в железо-аскорбатном, прооксидантном буферном растворе. Состояние ферментативных АО систем оценивали путём определения активности супероксиддисмутазы и каталазного числа. Установлено, что суспензия нанодисперсного кремнезёма наиболее эффективно восстанавливает работу АО систем и снижает показатели ПОЛ. Влияние изученных сорбентов на метаболизм L-аргинина позволяет предположить различную способность к сорбции фторид-ионов и нитрат-ионов.
Проблема накопления нитратов органического и неорганического происхождения в грунтах, подземных и поверхностных водах Евразии становится всё более актуальной в связи с развитием аграрной химии, поскольку нитраты применяются как питательный материал, увеличивающий скорость роста растений. Употребляя в пищу растения с повышенным содержанием нитратов, человек подвергается хронической нитратной интоксикации. Проблема избыточного содержания фтора в грунтах и питьевой воде, хотя и носит, как правило, эндемический характер, всё же является распространённым явлением на территории Евразии [1 ‚ 2]. Наличие эндемического очага с повышенным содержанием фтора в питьевой воде, развитый аграрный комплекс, использующий интенсивные технологии, создают условия, при которых возможно влияние на организм человека двух негативных факторов: нитратной и фторидной интоксикации.
Система крови является интегральным показателем состояния организма. Несмотря на то, что изменения в отдельных органах и системах могут быть более или менее выражены, оценка состояния системы крови позволяет сделать прогноз для организма в целом. Ионы фтора могут угнетать анаэробный гликолиз в эритроцитах. Это способствует снижению их осмотической резистентности, что приводит к их гемолизу. Также нами была установлена тенденция к угнетению активности сывороточной аргиназы и усилению общей активности NO-синтаз (NOS, ЕС 1.14.13.39) [3]. В литературе много упоминаний об угнетающем действии ионов фтора на антиоксидантные (АО) системы организма и усиление под воздействием фторидов генерации свободных радикалов [4]. Нитрат- ионы способствуют образованию нитрозильных комплексов с гемовым железом, превращая нормальный гемоглобин в метгемоглобин. По данным литературы, нитраты усиливают генерацию свободных радикалов и снижают активность АО системы [5]. Установлено, что нитрат натрия в дозе 500 мг/кг угнетает активность сывороточной аргиназы, однако сочетанное введение нитратов и фторидов не оказывает статистически значимого влияния на активность аргиназы крови [3]. Поскольку в некоторых регионах Евразии возможно одновременное влияние двух патогенных факторов, возникает необходимость в коррекции изменений, вызываемых одновременным поступлением в организм нитратов и фторидов в избыточных количествах. Эффективным методом коррекции изменений метаболизма при сочетанной интоксикации может стать энтеросорбция.
Цель исследования - проведение сравнительного анализа эффективности коррекции изменений, вызванных сочетанной нитратной и фторидной интоксикацией, в метаболизме Ĺ-ар- гинина, в функциональном состоянии АО систем, показателях пероксидного окисления липидов (ПОЛ) сорбентами разной химической структуры.
Материалы и методы. Эксперимент проведён на 62 белых крысах линии Wistar. Животные были разделены на 5 групп:
- I группа (10 крыс) - интактные животные, содержащиеся в стандартных условиях вивария;
- II группа (15 крыс) - животные с сочетанной интоксикацией;
- III группа (12 крыс) -введение сорбента на основе активированного угля (»Карболайн»);
- IV группа (15 крыс) - введение сорбента, полученного из древесины лиственницы (лигнин гидролизный);
- V группа (10 крыс) - введение суспензии нанодисперсного кремнезёма.
Хроническую сочетанную нитратно-фто- ридную интоксикацию воспроизводили путём введения через желудочный зонд 1 мл раствора, содержащего нитрат натрия, из расчёта 500 мг/кг, фторид натрия - 10 мг/кг. Материал на основе активированного угля - в виде суспензии полиэтиленоĸсида-400 (ПЭО-400) из расчёта 500 мг/кг. Лигнин гидролизный вводился - в виде суспензии на ПЭО-400 в дозе 500 мг/кг. Суспензию нанодисперсного кремнезёма на ПЭО-400 вводили из расчёта 100 мг/кг. Все манипуляции проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и других научных целей». Вывод животных из эксперимента осуществлялся путём забора крови из правого предсердия под тиопенталовым наркозом. Кровь в даль-
Таблица 1
Влияние энтеросорбентов на метаболизм L-аргинина, АО защиту и показатели ПОЛ.
|
Сочетанная |
Сорбент на |
Лигнин |
Суспензия |
||
|
Биохимический |
Интактная |
основе акти |
нанодисперсного |
||
|
анализ |
группа, n=10 |
интоксикация, |
вированного |
гидролизный, |
кремнезема, |
|
n=15 |
угля, n=12 |
n=15 |
n=10 |
Активность ÑО-синтазы,
|
мккат Активность аргиназы, |
193,75±33,3 |
104,19± 14,12* |
94,72±3,67 |
225,61 ±3,3**z*** |
279 ± 8,21 **z***z# |
|
мккат |
27,35±5,40 |
21,94±3,49 |
36,01 ±0,87** |
7,53±0,41**z*** |
14,44 ± 0,69**z***z# |
|
Содержание нитритов, нмоль |
3,91 ±0,47 |
36,69±0,96* |
30,20±0,79** |
19,81 ±1,0**z*** |
20,53 ± 2,59**z*** |
|
Активность SOD, у.е. |
1,35±0,08 |
1,49±0,07 |
1,33±0,13 |
1,86±0,15**z*** |
1,73 ± 0,09**z*** |
|
Каталазное число |
4,79±0,04 |
4,30±0,05* |
4,53±0,07** |
4,15±0,11 |
4,72 ± 0,19**/# |
|
Содержание ТБК-реак- тантов, мкмоль •до инкубации |
62,26±0,73 |
86,55±0,81* |
72,12± 1,13** |
73,69±1,13** |
60,56 ± 1,07**ź***/# |
|
• после инкубации |
70,2±0,59 |
100,24 ± 0,94* |
83,22± 1,11** |
84,76 ±1,15** |
70,32 ± 1,08**ź***/# |
|
• прирост |
7,93±0,39 |
13,7±0,13* |
11,1 ± 0,16** |
11,06±0,12** |
9,76 ± 0,14**z***z# |
- - p<0,05 относительно интактной группы
** - p<0,05 относительно сочетанной интоксикации
***- p<0,05 относительно сорбента на основе активированного угля
- - p<0,05 относительно лигнина гидролизного
нейшем использовалась для биохимических исследований.
Общую активность NOS оценивали по приросту нитритов (NO ") после инкубации в 2,5 мл трис-буферного раствора (pH=7,4) молярностью 0,1 М, который содержал 0,1 мл 1 тМ водного раствора НАДФН и субстрат NOS 0,3 мл 320 тМ водного раствора L-аргинина. Инкубация длилась 30 мин. [3]. Содержание нитритов определяли спектрофотометрическим методом по образованию азокрасителей в реакции NO - с реактивом Грисса [3].
Активность сывороточной аргиназы определяли по приросту содержания L-орнитина после 20-часовой инкубации в 0,5 мл фосфатного буферного раствора (рɪ 17,0) молярностью 0,1 М, который содержит субстрат аргиназ - 0,2 24 тМ водный раствор L-аргинина. Концентрацию L-орнитина определяли по нингидриновой реакции в кислой среде (pH=l,0) [3].
Показатели ПОЛ оценивали исходя из количества веществ, прореагировавших с тиобар- битуровой кислотой (ТБК-реактантов) [6] и их приростом после инкубации в железо-аскорбат- ном буферном растворе, для оценки состояния неферментативных АО. Определение активности супероксиддисмутазы (SOD, Е.С.1.15.1.1.) проводили по определению ингибирования ауто- окиснення адреналина в щелочной среде [7], каталазы (CAT, Е.С. 1.11.1.6.) - по убыванию содержания перекиси водорода в присутствии пробы [8]. Спектрофотометрические исследования выполнялись на фотоэлектрокалориметре «РМ-2111 Solar» (Беларусь).
Полученные результаты подвергались статистической обработке при помощи программы Microsoft Excel из набора программ Microsoft Office, а именно расширения Microsoft Excel - Real Statistics 2007. Данные, распределение которых было нормальным (гауссовым), подвергались параметрическому дисперсионному анализу (ANOVA) с последующими парными сравнениями с помощью t-критерия Стьюдента. При распределении, отличном от нормального, использовался непараметрический метод анализа по методу Крускала - Уолиса, с последующим сравнением по Манну - Уитни. В обоих случаях во избежание ложно-позитивных результатов при множественном сравнении использовалась поправка по методу Бонферонни. Различия считались статистически значимыми при р <0,05.
Результаты и их обсуждение: Сочетанная интоксикация уменьшает активность NOS на 46,22 % и статистически значимо не изменяет активность аргиназы. Сорбент на основе активированного угля не влияет на активность NOS, однако повышает активность аргиназы на 64,13 %. Применение лигнина гидролизного в качестве энтеросорбента при сочетанной интоксикации снижает активность аргиназы на
- %. При этом активность NOS увеличивается на 116,5 %. Суспензия нанодисперсного кремнезёма повышает активность NOS на 167,8 % относительно сочетанной интоксикации, активность аргиназы снижается на 34,18 %. При сравнении энеросорбентов установлено, что суспензия нанодисперсного кремнезёма увеличивает активность NOS относительно сорбента на основе активированного угля на 194,6 %, а относительно лигнина гидролизного на 23,66 %. Активность аргиназы снижается при сравнении с сорбентом на основе активированного угля на 59,9 %, но повышается при сравнении с лигнином гидролизным на 91,76 %. Данные различия могут быть связаны с различной способностью энтеросорбентов поглощать фториды и нитраты.
Способность поглощать экзогенные нитраты можно оценить по уровню нитритов в сыворотке крови. Нитриты образуются из экзогенных нитратов путём редукции в нитрат-редук- тазной системе организма. Важно учесть, что нитриты являются опасными для организма веществами, так как способны участвовать в реакциях нитрозилирования белковых молекул. Сочетанная интоксикация увеличивает содержание нитритов в 9 раз относительно интактных животных. Сорбент на основе активированного угля снижает количество нитритов на %, лигнин гидролизный - на 46 %, суспензия нанодисперсного кремнезёма - на 44 %. Суспензия нанодисперсного кремнезема снижает количество нитритов относительно сорбента на основе активированного угля на 32 % и не показывает статистически значимых различий относительно лигнина гидролизного. Лигнин гидролизный снижает содержание нитритов относительно сорбента на основе активированного угля на 34,4 %. Таким образом, суспензия нанодисперсного кремнезема эффективнее поглощает нитраты по сравнению с сорбентом на основе активированного угля и не уступает в этом отношении лигнину гидролизному.
Оценить способность к сорбции фторидов косвенным путём можно, проанализировав изменения в активности аргиназы. Фтор, по данным литературы, считается классическим ингибитором аргиназного пути метаболизма L-аргинина. Наши предыдущие исследования подтверждают этот факт, однако в условиях сочетанной интоксикации ингибирующий эффект фторидов компенсируется торможением активности NOS [3]. В группе животных, которым вводили сорбент на основе активированного угля, отмечена наивысшая активность аргиназ вместе с наибольшим содержанием нитритов. Поскольку активность аргиназ растёт, а активность NOS статистически значимо не изменяется, можно сделать вывод, что увеличение активности аргиназ связано с уменьшением ингибирующего влияния фторид-ионов. В группе лигнина гидролизного активность аргиназ наименьшая на фоне увеличенной активности NOS. Снижение активности аргиназ может быть связано с ингибирующим эффектом фторидов и конкурентным субстратным ингибированием NOS. Однако в группе нанодисперсного кремнезёма активность NOS и аргиназы увеличена, относительно группы лигнина гидролизного, что позволяет сделать вывод, что в уменьшении активности аргиназы более значимую роль играют ионы фтора, чем субстратная ингибиция.
Сочетанная нитратно-фторидная интоксикация не влияет на активность SOD и снижает каталазное число на 10,23 % относительно интактных животных. Сорбент на основе активированного угля не влияет на активность SOD, но увеличивает каталазное число на 5 % при сравнении с сочетанной интоксикацией. Лигнин гидролизный увеличивает активность SOD на 24,8 %, не влияя на каталазное число. Суспензия нанодисперсного кремнезёма повышает активность SOD на 16,1 %, каталазное число - на 9,7 %. Однако по сравнению с сорбентом на основе активированного угля статистически значимого различия в каталазном числе не обнаружено, активность SOD относительно группы лигнина гидролизного также статистически значимо не изменяется.
В группе животных, которым вводили нитрат натрия и фторид натрия в течение 30 дней, наблюдалось повышение содержания ТБК-ре- актантов до инкубации на 39 %, относительно интактной группы. Прирост ТБК-реактантов увеличивался на 21,79 %. Сорбент на основе активированного угля снижал содержание ТБК- реактантов до инкубации на 16,67 %, прирост - на 19 % при сравнении с сочетанной интоксикацией. Лигнин гидролизный показал схожую динамику. Содержание ТБК-реактантов до инкубации снизилось на 14,85 %, прирост - на 19,27 %. При сравнении этих сорбентов статистически значимых различий обнаружено не было. Суспензия нанодисперсного кремнезёма снизила содержание ТБК-реактантов до инкубации на 30 %, прирост - на 28,75 %. При сравнении суспензии нанодисперсного кремнезёма с двумя другими сорбентами различия являются статистически значимыми. Таким образом, суспензия нанодисперсного кремнезёма наиболее эффективно снижает показатели ПОЛ по сравнению с сорбентом на основе лигнина и активированного угля. Это объясняется тем, что влияние нанодисперсного кремнезёма влияет на оба звена супероксиддисмутазно-каталазной АО системы, чем уменьшает оксидативную нагрузку на организм.
Выводы. Суспензия нанодисперсного кремнезёма наиболее эффективно снижает показатели ПОЛ при сравнении с сорбентом на основе активированного угля (карболайн) и лигнином гидролизным. Суспензия нанодисперсного кремнезёма позитивно влияет на оба звена су- пероксиддисмутазно-каталазной системы. Суспензия нанодисперсного кремнезёма более эффективно адсорбирует нитраты, при сравнении с сорбентом на основе активированного угля (карболайн). Адсорбция фторидов суспензией нанодисперсного кремнезёма более выражена, чем у лигнина гидролизного. Таким образом, суспензия нанодисперсного кремнезёма эффективна в коррекции изменений в АО системах организма и снижении показателей ПОЛ, однако нуждается в модификации для более эффективного адсорбирования фторидов.
ЛИТЕРАТУРА
- Жовинский Э.Я., Крюченко Н.О. Прикладное значение геохимии фтора // Пошукова та еко- логічна геохімія. - 2007. № 1. - С. 3-13.
- Серикбаева А.К., Сатаева Л.M., Азимов А.М. Качество природных вод республики Казахстан // Междунар. науч, ин-т «Educatio». - 2015. - № 2 (9). - С. 21-23.
- Акǐмов О.Ĉ., Ковальова I.O., Костенко В.О. Функцíонування аргíназного та ÑО-синтазного шляху метаболíзму L-аргініну в кровí шурíв за умов надлишкового надходження нíтрату та фториду натрíю та застосування суспензíï нанодисперсного кремнезему // Актуальнí проблеми сучасноï медицини: Вíсн. Украïнськоï мед. стоматол. академíï. - 2016. - Т. 16, - № 1. - С. 169-173.
- Shushua X. A Role of Fluoride on Free Radical Generation and Oxidative Stress in BV-2 Microglia Cells / X-Shushua, L.Ziyou, Y.Ling [et al]//Mediators Imflamm. - 2012. - Vol. 13.-Art. 102954.-P. 1-8.
- Bouaziz-Ketata H. Nitrate-induced Biochemical and Histopathological Changes in the Liver of Rats: Ameliorative Effect of HypaiThenia hirta / H-Bouaziz-Ketata, G.B.Salah, H.B.Salah [et al.] // Biomed Envnon Sci. - 2014. - Vol. 27(9). - P. 695-706.
- Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - M.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
- Методи клİнİчних та експериментальних дослíджень в медицин! ⁄ [Л.В.Беркало, О.В.Бобо- вич, Н.О.Боброва ха ед.] // пíд ед. Ì.П.Кайдашев. - Полтава: Полíмет, 2003. - 96-99 с.
- Методи клİнİчних та експериментальних дослíджень в медицинí ⁄ [Л.В.Беркало, О.В.Бобо- вич, Н.О.Боброва Та ед.] // пíд ед. Ì.П.Кайдашев. - Полтава: Полíмет, 2003. - 89-90 с.