Эффективность стерилизующих веществ для обработки эксплантов родиолы розовой

Аннотация

Основное требование при культивировании клеток и тканей – соблюдение условий стерильности. Получение стерильных растений in vitrо является одним из важных этапов исследования. Выбор стерилизующего вещества, концентрация и время экспозиции зависят от плотности и чувствительности ткани, которая должна быть простерилизована. В работе проведены исследования по выбору стерилизующих веществ для обработки лекарственного растения, занесенного в Красную книгу Республики Казахстан Родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), для дальнейшего пассирования на питательную среду.

Ключевые слова: биотехнология, Родиола розовая, питательная среда, стерильность, культивирование

Лекарственное растительное сырье является богатейшим источником получения биологически активных веществ. В мировой медицинской практике более 30% лекарственных средств представляют собой лекарственные препараты из растений. На долю фитопрепаратов в России и странах СНГ приходится около 40% всех лекарственных средств [1].

Однако широкое использование растений для выделения биологически активных веществ привело к стремительному сокращению их природных ресурсов. Некоторые растения были отнесены к редким и исчезающим видам, многие растения восстанавливают свои площади произрастания длительное время.

Одним из таких растений, широко используемых в медицине, является Родиола розовая (Rhodiola rosea L.), - многолетнее травянистое растение из семейства толстянковых (Crassulaceae). В настоящее время Родиола розовая отнесена к исчезающему виду растений, ресурсы которой ограничены и внесена в Красную Книгу РК. В связи с этим, сохранение популяции редких и исчезающих видов растений методами интродукции, организации заповедников, создание плантаций и т.д. представляет важную проблему [2].

Наибольший научный интерес представляет культивирование растительных клеток in vitro, позволяющий выращивание культуры клеток и тканей в целях сохранения генофонда и их промышленного использования.

Биотехнологические препараты – лекарственные средства, полученные путем использования биологических объектов (микроорганизмов, клеток и тканей людей, растений, животных, клеток насекомых и млекопитающих, гибридомных клеток, дрожжей, генно-инженерных штаммов микроорганизмов, моноклональных антител, ДНК, РНК) и специальных технологических процессов (культивирование, ферментация, биотрансформация, экстракция и т.д.) [1,2,5].

К биотехнологическим лекарственным препараты относят: антибиотики, витамины, гормоны, ферменты, липиды, полисахариды, органические кислоты, аминокислоты, аллергены, антигены, препараты из крови и плазмы, а также вакцины, цитокины, иммуномодуляторы, иммуностимуляторы, иммунодепрессанты, иммунные сыворотки, иммуноглобулины, пробиотики, интерфероны , интерлейкины и др.[3,4].

Номенклатура лекарственных препаратов, полученных на основе биообъектов в силу объективных причин имеет тенденцию к своему расширению. В категорию таких лекарственных препаратов входят:

1. лекарственные средства для лечения, в число которых входят аминокислоты и препараты на их основе, антибиотики, ферменты, коферменты, кровезаменители и плазмозаменители, гормоны стероидной и полипептидной природы, алкалоиды;
2. профилактические средства, в число которых входят вакцины, анатоксины, интерфероны, сыворотки, иммуномодуляторы, нормофлоры;
3. диагностические средства, в число которых входят ферментные и иммунные диагностикумы, препараты на основе моноклональных антител и иммобилизованных клеток. Это далеко не полный перечень лекарственных препаратов, которые имеются в современной фармации, в основе производства которых используются биообъекты [3,4,5].

Первое место в мире по выпуску биотехнологической продукции занимает США, которая ежегодно выделяет 3 млрд. долларов на поддержку фундаментальных исследований в области медицины, из которых 2,5 млрд. долларов относится к области биотехнологии. Второй страной по выпуску биотехнологической продукции является Япония, третье место – Израиль [6].

Родиола розовая, или золотой корень, скрипун (Rhodiola rosea L.), - многолетнее травянистое растение из семейства толстянковых (Crassulaceae), является чрезвычайно полиморфным видом. В зависимости от условий обитания у нее в значительных пределах изменяются такие признаки, как кустистость, высота побегов, форма листьев, количество цветков, мощность корневой системы [6,7].

Химический состав сырья сложен, выявлены вещества различных классов: фенольные соединения фенолоспирты и их гликозиды, салидрозиды (родиолозиды); флавоноиды (кверцетин, гиперозид, кемферол и др.); антрагликозиды; дубильные вещества группы пирогаллола; эфирное масло, содержащее коричный альдегид и цитраль; органические кислоты; липиды; до 10 различных микроэлементов, содержащих большое количество марганца и другие соединения [8,9].

В настоящее время число видов Родиолы колеблется от 36 до 90, 7 обладают выраженными фармакологическими свойствами:

Rhodiola algida (Ledeb.) Fisch. &C.A.Mey. — Родиола морозная

Rhodiola kirilowii (Regel) Maxim. — Родиола Кирилова

Rhodiola pinnatifida Boriss. — Родиола перистонадрезанная

Rhodiola quadrifida (Pall.) Schrenk — Родиола четырёхнадрезанная

Rhodiola rosea L. — Родиола розовая

Rhodiola sachalinensis Boriss. — Родиола сахалинская

Rhodiola semenovii (Regel & Herder) Boriss. — Родиола Семёнова.

Среди растений рода Родиола (Rhodiola L.) сем. Толстянковых (Crassiilaceae) - особый интерес представляет родиола розовая или "Золотой корень" (Rhodiola rosea L.) [9,10].

Биологическая активность корневищ Родиолы розовой в основном обусловливается гликозидами коричного спирта, среди которых доминирующими компонентами являются розавин и салидрозид [9].

Компоненты растения способны повышать защитную функцию эритроцитов, что значительно повышает сопротивляемость нервной системы к стрессовым ситуациям. Препараты на основе растения активируют выработку глюкозы и кислорода в крови, что улучшает работу мозга и концентрацию внимания, снимает умственную и физическую усталость, предоставляя организму резервные силы. Родиола розовая способна нормализовать давление, повысить эластичность стенок и проходимость кровеносных сосудов, уменьшить мигреневые боли. Компоненты растения оказывают антимикробные действие на бактерии стафилококка, гонорейную палочку, нивелируют образование раковых клеток [10,11].

Растение произрастает в полярно - арктической и альпийской зонах, равнинных и горных тундрах севера Европейской части России, на Северной Урале, горах Алтая, Саянах, Восточной Сибири, на Тянь- Шане и Дальнем Востоке. В странах СНГ ареал находится в Казахстане, Киргизии, на Украине (Карпаты). Еще сравнительно недавно природные запасы золотого корня были достаточно велики. Так, в горах Алтая и на западных склонах Саян запасы корневищ родиолы розовой составляли свыше 500 т, в горах на юге Сибири - свыше 1500 т воздушносухого сырья [11,12].

Однако в результате нерегулируемых заготовок природные запасы сырья данного растения сильно истощены. Родиола розовая занесена в «Красную книгу» и промысловые заготовки сырья возможны только в очень ограниченных объемах.

По этой причине выпуск лекарственных средств - родиолы экстракт жидкий, таблетки «Родаскон» осуществляется в небольших объемах, недостаточных для удовлетворения потребностей здравоохранения [13].

При условии рациональной эксплуатации заросли родиолы розовой восстанавливаются очень медленно, поэтому становится очевидным, что проблему сырьевой базы можно решить только путем промышленного культивирования данного растения [11,12,13].

Нами проведены исследования по культивированию in vitro лекарственного растения Родиолы розовой с целью сохранения природных ресурсов путем выращивания культуры клеток с последующим ее размножением для пересаживания на плантациях.

Особое внимание при культивировании изолированных клеток, тканей и органов растений уделяется вопросам требований по подготовке условий работы, приготовлению питательных сред, получению стерильного интактного материала.

Основное требование при работе с тканевыми культурами - соблюдение условий стерильности, поэтому для работы необходимо иметь предварительно вымытые, простерилизованные в сушильном шкафу посуду и инструменты [11,12].

Посуду тщательно вымыли в растворах детергентов (стиральный порошок, мыльная вода), затем отмыли от детергентов 8-10-ти порциях проточной воды.

Чистую посуду поместили в сушильный шкаф на 2 часа при температуре 130-170°С. Металлические инструменты завернули в плотную бумагу и поместили в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при температуре 170-200°С в течение 2 часов.

Непосредственно перед работой инструменты погружали в 96 % раствор этилового спирта и прожигали их рабочие поверхности над пламенем спиртовки [12].

Основой всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь шести минеральных солей. К необходимым макроэлементам относят азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо, а к микроэлементам - бор, марганец, цинк, медь, молибден, кобальт и др.[11,12,13].

В состав питательных сред обязательно входит кислота этилендиаминтетрауксусная (ЭДТА) или ее натриевая соль (Nа2ЭДТА), которые улучшают доступность железа. В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 20-30 г/л. Для стимуляции биохимических процессов в клетке используют витамины группы В: тиамин-НС1 (В1), рибофлавин (В2), Са-пантогенат (В5), пиридоксин-HCl (В6), аскорбиновая кислота (С), никотиновая кислота (РР), мезоинози [12,13].

В целях экономии времени можно готовить маточные (концентрированные) растворы солей. Растворы макросолей готовят в 7-10 раз более концентрированными, а растворы микросолей - в 100 раз более концентрированными.

Приготовление маточных растворов для питательных сред. Растворы макро- и микросолей готовили согласно прописям из реактивов высокой химической чистоты (имеющих маркировку ХЧ, Ч, ЧДА) с проверенным сроком годности. Навески макро- и микроэлементов взвешивали в стеклянных стаканчиках, а витаминов, фитогормонов и других добавок - на часовых стеклах. Углеводные компоненты среды и агар можно взвешивать на пергаментной бумаге.

Нами были приготовлены маточные растворы макроэлементов, микроэлементов, хелата железа, ауксинов, цитокининов, витаминов.

Приготовление питательной среды производили из предварительно подготовленных маточных растворов макро- и микроэлементов, витаминов, регуляторов роста. Для приготовления 1 л среды в стакан объемом 1 л, пипеткой перенесли необходимый объём каждого из исходных растворов (маточных растворов). Затем растворили в небольших объемах дистиллированной воды (каждый в отдельности) мезоинозит, глицин, сахарозу и полученные растворы внесли в стакан с маточными растворами. Довели объем полученной жидкой питательной среды дистиллированной водой до 950 мл. Затем довели pH среды до требуемого значения [13,14].

Получение стерильного интактного растительного материала. На начальной стадии исследования важно подобрать оптимальные условия для стерилизации эксплантов Родиолы розовой (Rhodiola rosеа L.). Необходимость введения в культуру in vitro стерильных растений Родиолы розовой (Rhodiola rosеа L.) была обусловлена трудностями, связанными с инициацией образования и развития стерильной недифференцированной ткани (каллуса) и разработки условий ее культивирования.

Поверхностные покровы всех органов растений обычно загрязнены спорами микроорганизмов и грибов, тогда как внутренние ткани здоровых, неповрежденных растений считаются стерильными. Для поверхностной стерилизации растительных тканей применяли простой набор химических веществ [14].

Наиболее часто употребляют соединения, содержащие активный хлор (натрия гипохлорит, калия гипохлорит, хлорная известь, хлорамин), ртуть (сулема, диацид), перекись водорода, спирт этиловый. Реже используют бром, серную кислоту, фенол и в особых случаях для стерилизации применяют антибиотики (таблица 1).

В таблице 1 представлены исследованные нами 8 различных стерилизующих составов, время экспозиции, условия отмывки и эффективность стерилизации.

Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительный материал родиолы розовой поместили на несколько секунд в стерилизующий раствор и отмечали время начала стерилизации. Концы отрезков стеблей, корней, черешков, листьев, пазушных и верхушечных почек парафинировали во избежание попадания стерилизующего вещества, которое может вызвать повреждение тканей. Растительный материал, погруженный в стерилизующий раствор, внесли в ламинар-бокс. По истечении времени стерилизации, растительный материал стерильным пинцетом перенесли в сосуды со стерильной водой, выдерживая в каждом из них по 5 мин. Простерилизованные и промытые объекты, поместили в стерильные чашки Петри, затем переносили фрагменты тканей на питательные среды. Эффективность стерилизации для каждого отдельного агента оценивали по площади зараженности питательных сред.

Таблица 1 - Эффективность различных составов для стерилизации эксплантов

Заключение. В результате было установлено, что с увеличением продолжительности стерилизации снижается число инфицированных эксплантов, но при этом снижается их жизнеспособность.

Низкая эффективность стерилизации наблюдалась при использовании стерилизующих растворов №4, 6, 7, 8. Средняя эффективность стерилизации отмечено в объектах №1, 2. Высокая эффективность стерилизации наблюдалась при двухступенчатой стерилизации раствором перманганата калия 0,1%, затем раствором диацида 0,1% и твин-80 (10:0,01) – 92% и при стерилизации раствором спирта этилового 96% и раствором кальция гипохлорита 10% (1:1).

Для дальнейших исследований нами выбран стерилизующий раствор спирта этилового 96% и кальция гипохлорита (1:1), так как раствор менее токсичен для тканей растений в сравнении с раствором диацида, эффективность стерилизации составила 90%.

Литература

1. Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для высш. пед. учеб. заведений/ Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. – 2-е изд., стер. – М.: Академия, 2005. – 208 с.
2. Биотехнология растений: учебник и практикум для бакалавриата и магистратуры Л. В. Назаренко, Ю. И. Долгих, Н. В. Загоскина, Г. Н. Ралдугина. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Издательство Юрайт, 2018. - 161 с.- (Серия: Университеты России).
3. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений, С.- Пб университет, 2003, 228 с.
4. Бутенко, Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений /Р. Г. Бутенко. - М.: Наука, 1964.
5. Бутенко, Р. Г. Культура тканей и клеток растений / Р. Г. Бутенко. - М.: Знание, 1971.
6. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных клеток и тканей в решении задач физиологии растений / Р.Г. Бутенко // Новые направления в физиологии растений. - М.: Наука, 1985.- С. 270.
7. Биотехнология: учебное пособие / Н.И. Коростелева, Т.В. Громова, И.Г. Жукова. Барнаул: Изд- во АГАУ, 2006
8. Биотехнология растений: учебное пособие/Г.Ж.Валиханова Павлодар: Кереку, 2009. -272 с., переиздание
9. Petkov V.D., Yonkov D., Mosharoff A., Kambourova T., Alova L., Petkov V.V. et al. Effects of alcohol aqueous extract from Rhodiola rosea L. roots on learning and memory // Acta Physiol Pharmacol Bulg. 1986. Vol. 12, no. 1. P.3-16.
10. Calcabrini C. et al. Rhodiola rosea ability to enrich cellular antioxidant defences of cultured human keratinocytes // Arch. Dermatol Res. 2010. No.3. P. 191-200.
11. Саратиков А.С., Краснов Е.А. Родиола розовая (золотой корень). 4-е изд., перераб. и доп. Томск: Изд-во Томского ун-та, 2004. 292 с.
12. Астафьев М. В. Экологические особенности интродукции родиолы розовой в условиях Самарской области // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2007. - Т. 9, №4. - С. 1079-1084.
13. Buchwald W., Mscisz A., KrajewskaPatan A., Furmanowa M., Mielcarek S., Mrozikiewicz P.M. Contents of biologically active compounds in Rhodiola rosea roots during the vegetation period // Herba Polonica. 2006. Vol. 52, no. 4. P. 3943.
14. Tasheva K., Kosturkova G. The role of biotechnology for conservation and biologically active substances production of Rhodiola rosea: endangered medicinal species // The Scientific World Journal. 2012.