Изучение влияния ассоциаций дрожжей и бактерий на биологическую активность нефтезагрязненных почв в модельных опытах

Проблема очистки почв и водных экосистем, загрязненных нефтью, продуктами ее переработки и отдельными ее компонентами, до сих пор остается не решенной. Однако, несмотря на предпринимаемые усилия по предупреждению разливов нефти на поверхность воды и почвы, в процессе добычи или транспортировки аварийные разливы нефти, к сожалению, пока неизбежны, а ликвидация нефтяных загрязнений является исключительно трудоемкой и весьма дорогой задачей. Кроме того, углеводороды нефти способны образовывать в процессе трансформации токсичные соединения, обладающие канцерогенными, тератогенными и мутагенными свойствами, стойкостью к микробиологическому расщеплению и способностью переходить в растения, что значительно снижает качество возделываемых культур и создает угрозу для здоровья человека и животных. Действие нефтяных компонентов особенно сказывается в изменении экологической обстановки: пропитывая почву, обволакивая корни, листья, стебли растений и проникая сквозь мембраны клеток, нефть нарушает водно-воздушный баланс среды и организмов, обмен веществ и трофические связи. Существующие механические, физические и химические методы очистки не обеспечивают необходимого уровня очистки воды и грунта, поэтому большое внимание уделяется биологическим методам очистки [1-2].

Значительный вклад в процесс разрушения нефтяных углеводородов вносят организмы, способные использовать углеводороды в качестве единственного источника органического вещества и энергии. Такие формы имеются только среди микроорганизмов. Многим микроорганизмам характерна способность, усваивать углеводороды в качестве единственного источника углеродного питания. Этим они резко отличаются от всех остальных представителей органического мира. Они широко распространены в природе, принадлежат ко многим таксономическим группам, являются обычными членами микробных ценозов. Особенно, в больших количествах, они встречаются в местах сильно загрязненных нефтью и нефтепродуктами [3].

Специалисты в области биотехнологии по биодеградации нефти и нефтепродуктов проводят выделение и отбор специализированных видов микроорганизмов - деструкторов углеводородов нефти из загрязненных мест. Такие микроорганизмы хорошо адаптированы к местным условиям и при высокой удельной нефтебиодеструктивной активности весьма эффективны. Вопросам микробной очистки сточных вод и почвы от нефти и нефтепродуктов посвящено большое количество работ и в то же время немногочисленны исследования, касающиеся биодеградации труднодоступных нефтепродуктов. В них приводятся микроорганизмы, которые используются в очистки: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterum, Mycobacterium, Beijerinckia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, SpaerotilusSerratia, актиномицеты, микроскопические грибы и дрожжи [4].

Использование биомасс отдельных штаммов нефтеокисляющих бактерий малоэффективно для очистки почв от нефти и нефтепродуктов. Поэтому проводятся работы по созданию консорциумов микроорганизмов, состоящих из ряда природных бактериальных и дрожжевых ингредиентов, и на этой основе создаются «биопрепараты», используемые для очистки почв от нефти и нефтепродуктов. При этом в состав консорциумов включаются от 2 до 5-6 компонентов. Так, смешанная культура бактерий, состоящая из 3-х компонентов - псевдомонад, микобактерий и артробактера, разработанная Т.И. Комаровой [5], в стационарных условиях использует 86% нефти в течении 5 суток совместного роста. Применение таких биопрепаратов интенсифицирует метаболизм нефтезагрязненных почв, в частности, увеличивается активность гидролитических и окислительно- восстановительных ферментов. Однако, нам известно что, препараты, разработанные в России не применимы в условиях Казахстана

Целью настоящей работы было исследование продуктивных ассоциаций бактерий и дрожжей, способных утилизировать углеводородосодержащие соединения в нефтезагрязненных почвах месторождения Косшагыл.

Материалы и методы исследований. Объектами исследований служили активные штаммы нефтеокисляющих бактерий и дрожжей, выделенных из загрязненных нефтью почв месторождения Косшагыл Атырауской области. Для постановки модельных экспериментов по изучению влияния ассоциаций бактерий на деградацию нефти использовали почву месторождения Косшагыл – солонец пустынный. В сосуды помещали по 50г почвы, затем искусственно загрязняли ее нефтью того же месторождения в количестве 2,5 г и 5 г, что соответствует 5% и 10% нефтезагрязнению. Степень утилизации нефти определяли гравиметрическим методом. Численность основных групп микроорганизмов в нефтезагрязненной и чистой почве определяли общепринятыми микробиологическими методами

Для определения каталазной активности измельченную почву (1г) вносили в сосуд емкостью 100 мл, добавляли 0,5 г СаСО3. Осторожно помещали на дно маленький стаканчик с 5 мл 3%-ного раствора перекиси водорода. Склянку плотно закрывали пробкой с трубкой, соединенной с бюреткой и сообщающейся с грушей. Бюретку и грушу заполняли водой. Сосуд с перекисью опрокидывали и взбалтывали в течение 1 минуты. Каталазную активность выражали в мл О2, выделившегося за одну минуту на грамм почвы. Для определения дегидрогеназной активности 1 г почвы помещали в пробирку, добавляли 0,1 г CaCО3, 1 мл 0,1 М раствора глюкозы и 1 мл 1%-ного раствора трифенилтетразолия хлористого. Содержимое пробирки тщательно смешивали, закрывали, удаляли кислород и культивировали в течение двух суток при 30 єС. Образовавшийся формазан экстрагировали

50 мл этанола и фильтровали. Дегидрогеназную активность выражали в единицах оптической плотности. Оптическую плотность определяли на цифровом ФЭКе AP-101 (Япония) при длине волны 460 нм. Липазную активность почвы определяли по методу Козлова и выражали в мл 0,1 н КОН на 1 г почвы. Дыхательную активность почвы определяли весовым методом Изермейера и выражали в г поглощенного СО2.

Результаты и их обсуждение. В результате скрининга проведенного среди культур, выделенных из нефтезагрязненных почвенных образцов месторождения Косшагыл Атырауской области, были отобраны наиболее активные штаммы, характеризующиеся повышеннной способностью к утилизации углеводородов нефти. В лабораторных условиях были поставлены модельные опыты по изучению влияния ассоциаций дрожжей и бактерий на биологическую активность нефтезагрязненных почв. Для опытов использовали почву - солонец пустынный Атырауской области, количество вносимой нефти составляло 5%. В качестве нефтеутилизирующих микроорганизмов использовали бактериальную ассоциацию Arthrobacter sp.П1 + К3 и ассоциацию бактерий и дрожжей Arthrobacter sp. П1 и К3+ Candida sp. ФС-4АТ, показавших наиболее хорошие результаты в предварительных опытах. В сосуды помещали по 50 г почвы, затем искусственно загрязняли ее нефтью того же месторождения.

Эксперимент включал следующие варианты:

  1. почва + нефть 5 г/100 г почвы (контроль);
  2. почва + нефть 5 г/100 г почвы + ассоциация 1 (штаммы Arthrobacter sp. П1 и К3);
  3. почва + нефть 5 г/100 г почвы + ассоциация 2 (штаммы Arthrobacter sp. П1 и К3+ Candida sp. ФС-4АТ);

Для исследования биологической активности почвы изучали микробиологические и биохимические показатели почвы. Микробиологическую характеристику и активность микробных ферментов почвы (каталаза, дегидрогеназа, липаза), а также активность дыхания почв, исследовали в динамике, проводя отбор проб через 7, 30 и суток после внесения нефти и культур микроорганизмов.

Для оценки микробного разнообразия почвы были выбраны такие показатели, как количество микроорганизмов различных таксономических групп, а также численность бактерий разных физиологических групп (гетеротрофы, олиготрофы, споровые) (табл. 1).

Таблица 1. Динамика изменения численности микроорганизмов различных таксономических групп в модельных опытах с 5%-ным нефтезагрязнением почвы

Длит. опыта

Варианты опыта

Бактерии, КОЕ/г почвы

Актином ицеты, КОЕ/г почвы

Дрожжи

, КОЕ/г почвы

Грибы, КОЕ/г почвы

Нефтеоки сляющие, КОЕ/г почвы

Гетеротр офные

олиготро фы

споров ые

1

2

3

4

5

6

7

8

9

7 сут.

Контроль (почва)

2,1Ч109

1,4Ч105

5,4Ч103

3,0Ч107

1,0Ч102

3,0Ч103

0

 

Контроль 1(почва +нефть)

1,3Ч1010

2,4Ч107

4,8Ч103

2,7Ч107

1,3Ч103

5,2Ч103

0

 

Ассоциация П1+К3

7,4Ч109

1,1Ч108

4,1Ч103

2,1Ч107

0,9Ч102

1,1Ч103

+

 

Ассоциация П1+К3+ФС-4АТ

2,5Ч1010

1,8Ч107

3,8Ч103

1,8Ч107

3,8Ч105

2,5Ч102

+

30 сут.

Контроль (почва)

2,8Ч109

2,5Ч105

5,7Ч103

3,2Ч107

0,2Ч102

2,8Ч103

0

 

Контроль 1(почва +нефть)

1,2Ч1010

4,8Ч107

5,0Ч103

2,9Ч107

0

0

0

 

Ассоциация П1+К3

9,2Ч109

5,9Ч108

5,8Ч103

1,1Ч107

2,6Ч102

2,1Ч103

с.р.г*

 

Ассоциация П1+К3+ФС-4АТ

6,8Ч1010

4,9Ч107

5,6Ч103

1,5Ч107

6,0Ч105

2,7Ч102

с.р.г

Из табл. 1 видно, что в начале проведения опытов (7 сутки) микробный состав контрольной, загрязненной и рекультивированной с помощью ассоциаций микроорганизмов почв был разнообразен и в нем присутствовали все таксономические группы микроорганизмов: бактерии, актиномицеты, дрожжи и грибы. Однако с течением времени микрофлора нефтезагрязненной почвы существенно менялась. Так, через 30 сут практически исчезли из микрофлоры загрязненной почвы грибные и дрожжевые организмы. Численность актиномицетов осталась практически без изменения. Исследование численности бактерий показало, что число гетеротрофных и олиготрофных бактерий в нефтезагрязненной почве несколько увеличилось по сравнению с контролем.

Проведение биоремедиации с помощью нефтеокисляющих ассоциаций существенно изменило микробный пейзаж почвы. Так, при биоремедиации почв сохранился состав всех таксономических групп микроорганизмов, однако существенно изменилось их количество. Так, если количество актиномицетов в загрязненной почве составляло 2,0Ч107 КОЕ/г, то в вариантах опытов с ассоциациями П1 + К3 и П1 + К3 + ФС-4АТ оно составляло 5,1Ч102 и 2,0Ч102 КОЕ/г почвы соответственно. Отмечено, что в процессе биоремедиации почвы число микроскопических грибов снижается на порядок, а в вариантах опытов с ассоциацией П1 + К3 + ФС - 4АТ выявлено увеличение содержания дрожжей на три порядка по сравнению с исходной почвой на фоне значительного возрастания числа нефтеокисляющих микроорганизмов.

Таким образом, проведение биоремедиации с ассоциациями нефтеокисляющих микроорганизмов приводит к значительному увеличению количества бактерий разных физиологических групп, что свидетельствует об активизации почвенных процессов.

Одним из показателей реально отображающих экологическое состояние почвы, является ферментативная активность почв, рассматриваемая как совокупность процессов, катализируемых ферментами почвенной биоты. С этой целью в модельных опытах изучали динамику изменения таких почвенных ферментов, как каталазы, дегидрогеназы, липазы, а также дыхательную активность почв.

Из данных таблицы 2 видно, что исходная почва характеризуется крайне низкой активностью почвенных ферментов. Это объясняется высокой засоленностью данного типа почвы, что отрицательно сказывается на ее ферментативной активности. При внесении в почву нефти в количестве 5% активность дегидрогеназы через 30 суток увеличивается в 2,5 раза по сравнению с этими показателями у исходной почвы, при этом активность каталазы несколько увеличивается с течением времени, а активность липазы практически не меняется. Эти данные хорошо коррелируют с увеличением численности гетеротрофных и олиготрофных бактерий, которые являются одними из основных физиологических групп микроорганизмов, отвечающих за биологическую активность почв.

Таблица 2. Динамика изменения ферментативной активности почвы с нефтяным загрязнением в процессе биоремедиации

Варианты опыта

Активность почвенных ферментов

7 суток

1 месяц

Дегидрогеназа

,

Каталаза,

О2/мин/г

Липаза, мл/0,1н

Дегидрогеназа, мкгТФФ/г/сут.

Каталаза,

О2/мин/г

Липаза, мл/0,1н

 

мкгТФФ/г/сут.

 

КОН/мин.

   

КОН/мин.

Контроль (почва)

0,12

2,2

3,6

0,12

2,2

3,6

Контроль 1 (почва +нефть)

0,30

2,4

3,6

0,60

2,6

3,3

Ассоциация П1+К3

0,75

2,0

3,8

0,35

1,8

3,7

Ассоциация П1+К3+ФС-4АТ

0,87

2,8

3,6

0,65

1,5

4,3

При проведении биоремедиации нефтезагрязненных почв с использованием ассоциаций микроорганизмов показано, что активность почвенных ферментов значительно возрастает по сравнению с их уровнем как в исходной, так и в нефтезагрязненной почве. Установлено незначительное снижение активности микробных ферментов почвы во всех вариантах опытов после 30 суток биоремедиации, видимо, это связано с тем, что микроорганизмы к этому времени утилизируют легкие фракции нефти и перестраиваются для усвоения трудноутилизируемых фракций нефти.

Одним из важнейших показателей жизнедеятельности микроорганизмов почвы является почвенное дыхание. Дыхание почвы является не только показателем биохимических и биологических процессов, но также и показателем плодородия почвы в целом. В этой связи изучали влияние ассоциаций дрожжей и бактерий на активность дыхания в нефтезагрязненных почвах в течение двух месяцев, отбор проб проводили еженедельно. Дыхательную активность почвы выражали в поглощенного диоксида углерода. Полученные данные представлены в табл. 3

Таблица 3. Динамика активности дыхания в нефтезагрязненной почве в процессе биоремедиации

Варианты опыта

Дыхательная активность почвы

Дата отбора проб

28.06.10

12.07.10

26.07.10

12.08.10

26.08.10

Контроль (почва)

0,12

0,13

0,11

0,09

0,11

Контроль 1(почва +нефть)

0,13

0,13

0,17

0,16

0,15

Ассоциация П1+К3

0,14

0,17

0,16

0,16

0,20

Ассоциация П1+К3+ФС-4АТ

0,13

0,18

0,17

0,17

0,18

Как видно из таблицы 3, почва характеризовалась низким уровнем активности дыхания, что указывает на нахождение в ней микроорганизмов в неактивном физиологическом состоянии. Внесение нефти в количестве 5% несколько активизировало дыхательную активность, в то же время применение ассоциаций нефтеокисляющих микроорганизмов приводило к увеличению активности дыхания почвы в 1,6 - 1,8 раза по сравнению с исходной почвой и в 1,2 - 1,3 раза по сравнению с нефтезагрязненной почвой.

Таким образом, показано, что применение для биоремедиации ассоциаций микроорганизмов существенно влияет на микробиологические показатели почвы, активизируя не только ферментативную активность нефтезагрязненных почв, значительно повышая дегидрогеназную, каталазную и липазную активность почвы, но и увеличивая активность дыхания и, тем самым, положительно влияя на ее плодородие. Установлено, что наиболее высокие показатели биологической активности почвы были при использовании ассоциация бактерий и дрожжей П1+К3+ФС-4АТ.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Активность почвенной микрофлоры в условиях нефтяных загрязнений/ Л.И. Сваровская, Л.К. Алтунина // Биотехнология. − 2004. № 3. − С. 63 - 69.
  2. Биотехнологические подходы в очистке нефтезагрязнений окружающей среды / М.Х. Шигаева, Т.Д.Мукашева //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2007. - № 1 (31). –С. 35 − 42.
  3. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикл. биохимия и микробиология. − 1996. − Т. – 32, вып. 6. − С. 579 − 585.
  4. Интенсификация биодеградации нефтезагрязненных почв /Водопьянов В.В., Н.А.Киреева, Т.С.Онегова // Нефтяное хозяйство. – 2002. − № 12. –С. 128 − 129
  5. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. - Уфа: Недра, 1994. –171 с.

 

Год: 2011
Город: Алматы