Распространенность полиморфизма гена cyp2c19 у жителей Актюбинской области

Целью исследование изучить распространенность полиморфных вариантов CYP2C19 у жителей Актюбинской области, у больных с острым коронарным синдромом после чрескожного коронарного вмешательства.

Мы исследовали 100 пациентов с документированным острым коронарным синдромом, которым был имплантирован стент и назначено двойная антиагрегантная терапии (аспирин + клопидогрел), средний возраст которых составил 49,2. Контрольная группа была сформирована из 255 добровольцев без клинических и электрокардиографических проявлений ишемии и сердечнососудистых заболеваний. В группах пациентов и добровольцев, большинство были казахами 67% и 72% соответственно. Наше сравнительное небольшое исследование, выполненное в популяции смешанного проживания, позволило выявить носительство CYP2C19*2 у 1/3 пациентов и волонтеров. Результаты показали, что казахи, несут генетические варианты, подобные другим азиатам.

Таким образом, около 30% пациентов с острым коронарным синдромом, проживающие в Актобе, являются «медленными метаболизаторами» и находятся под возможной угрозой возникновения новых сердечно-сосудистых катастроф в связи низкой чувствительностью к клопидогрелу.

Ведение. Острый коронарный синдром (ОКС) является наиболее частой причиной госпитализаций и летальных исходов больных с ишемической болезнью сердца и в Казахстане являются причиной почти 1/3 всех смертей[1].

Тромботические окклюзии артерий и вен являются основной причиной смерти и инвалидизации большинства больных сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Эффективность антитромботической терапии в лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний доказана в многочисленных исследованиях[2], что нашло отражение в плановому чрескожному коронарному вмешательству (ЧКВ). Клопидогрел является одним из компонентов так называемой двойной антиагрегантной терапии, которая обязательна у больных, переживших все виды острых коронарных синдромов (ОКС), вне зависимости от тактики ведения, а также у пациентов, подвергнутых ЧКВ.

Изучение двойной антиагрегантной комбинации препаратов (аспирин и клопидогрел) с помощью различных лабораторных тестов обнаружило индивидуальную вариабельность в реакции на эти лекарства. Было показано, что недостаточное подавление функции тромбоцитов на фоне лечения может привести к увеличению риска сердечно сосудистых осложнений, то есть появлению «резистентности» к пероральным антиагрегантным препаратам. Причины «резистентности» к клопидогрелю разнообразны: к негенетическим факторам относятся возраст, сахарный диабет, почечная и сердечная недостаточность, а также генетические факторы, в первую очередь, носительство некоторых аллелей CYP со сниженной или отсутствием функциональной активности (CYP2C19*2)[2-8]. Отмечено не менее, чем трех-кратное увеличение риска коронарных событий (в частности, тромбоза стентов) при наличии признаков резистентности к клопидогрелу [9-11]. Оказалось, что в гене CYP2C19, контролирующем метаболизм клопидогрела в печени, встречаются полиморфизмы, т.н. медленно функционирующие аллели. У носителей медленно функционирующих аллелей образуется меньше активного метаболита и, соответственно, в меньшей степени подавляется функция тромбоцитов, следствием чего можно ожидать большую частоту тромботических осложнений у больных после ЧКВ, получающих клопидогрел.

В настоящее время стало очевидным, что системам транспортеров и биотрансформации большинства лекарственных средств, в том числе клопидогрела, присущ генетический полиморфизм, характеризующийся наличием изоформ ферментов с высокой или низкой активностью. Соответственно, имеются генетические особенности, влияющие на фармакокинетический ответ у конкретного больного, что дает возможность индивидуального подхода к выбору антиагрегантных препаратов, так и их доз, обеспечивая тем самым максимально эффективное и безопасное лечение.

Наша работа ставит своей целью изучить распространенность полиморфных вариантов CYP2C19 у жителей Актюбинской области, у больных с острым коронарным синдромом после чрескожного коронарного вмешательства.

Методы. Настоящее фармакогенетическое исследование является открытым, проспективным, когортным. Протокол исследования утвержден на заседании локальной этической комиссии Западно-Казахстанского государственного медицинского университета имени М.Оспанова (ЗКГМУ).

Участники исследования: В исследование включены 100 пациентов с документированным ОКС, которым был имплантирован стент и назначена двойная антиагрегантная терапия (аспиринÁклопидогрел). Диагноз ОКС установлен при наличии по крайне мере двух из следующих критериев:

Характерная боль за грудиной. 2.ЭКГ признаки ишемии или некроза миокарда. 3.Характерный подъем уровня сывороточных маркеров некроза миокарда в два раза выше верхней границы нормы. Коронарная ангиография проводилась в течение двух дней от начала симптомов. Коронарный стеноз определялся при сужении диаметра сосуда на ≥ 50¿.

Информирование согласие в письменном виде получено от всех участников, форма его (согласия) была одобрена локальным этическим комитетом нашего ЗКГМУ имени .М.Оспанова.

Сбор данных и записи в медицинских картах.

Все пациенты, включенные в исследование, являлись жителями Актюбинской области коренной казахской и славянской национальностей. Демографические данные и информация о факторах риска от всех пациентов получены из записей в медицинских картах на момент поступления в отделение интервенционной кардиологии больницы скорой медицинской помощи (БСМП) и медицинского центра Западно-Казахстанского государственного медицинского университета, Актобе, Казахстан, с октября 2014 по март 2015. К пациентам с артериальной гипертензией (АГ) относились лица, которые имели повышенное артериальное давление (> 140/90 мм.рт.ст) при трехкратном измерении, или если пациенты уже получали антигипертензивные препараты. К пациентам, страдающим сахарным диабетом (СД) относились лица имеющие уровень глюкозы в крови натощак 126мг/дл (6,1 ммоль/л) или уже получающие

Таблица1 - Клиническая характеристика и факторы риска лечение от диабета. Семейный анамнез устанавливался, если были выявлены преждевременные случаи наступления инфаркта миокарда или внезапной коронарной смерти у родствеников первой линии (например, родители, родные братья и сестры, дети). Статус курильщика определялся как: постоянный курильщик, если участник курил регулярно по одной сигарете в день и/или по одной сигаре или по одной трубке в неделю. Участники, которые в прошлом выкуривали по одной сигарете в день и/или по одной сигаре, или по одной трубке в неделю считались бывшими курильщиками. Никогда не курившими считались лица, которые не курили любой табачный продукт регулярно. Недавно бросившими курить считались участники, если они не курили в течение шести месяцев до поступления в исследования.

В зависимости от типа ОКС пациенты разделены на группы инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST и без подъема сегмента ST, нестабильная стенокардия диагностирована, если уровень биохимических маркеров некроза был в пределах нормальных значении. Пациенты, которые первоначально поступили с диагнозом нестабильная стенокардия, у которых инфаркт миокарда развился во время нахождения в стационаре, были отнесены в группу инфаркта миокарда.

Критерии включения в исследования: больные ОКС с подъемами сегмента ST и больные ОКС без подъемов сегмента ST, информированное согласие пациента, возраст от 18 до 90 лет.

Критерии исключения: больные с кардиомиопатией, с пороками сердца, тяжелыми соматическими и неврологическими болезнями, больные, не давшие согласие на участие в исследовании, больные, нарушавшие режим применения лекарств (аспирина и клопидогреля).

При включении в исследование в случае необходимости проводили коррекцию медикаментозного лечения в соответствии с международными рекомендациями. Стандартная доза клопидогрела 75 мг в день и аспирина 100 мг в день была назначена всем пациентам. Всем больным помимо антиагрегантной терапии в отсутствие противопоказаний был рекомендован прием В-блокаторов, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента и статинов.

Контрольная группа была сформирована из 255 добровольцев без клинических и электрокардиографических проявлений ишемии и сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Эта контрольная группа была включена для сравнения распределения генотипа в группе ОКС.

Забор крови и геномное усиление: Образцы крови для выделения ДНК были собраны в 3 мл пробирки, содержащие ЭДТА калия. Общую геномную ДНК выделили из лейкоцитов периферической крови с помощью метода консервации. Две единичные нуклеотидные полиморфизмы CYP2C19 * 2 (G681A, rs4244285), CYP2C19 * 3 (G636A, rs4986893) и от каждого пациента были оценены с использованием коммерческих зондов TaqMan (Примененные биосистемы, Пейсли, Великобритания) на ABI 7900HT быстрый ПЦР в реальном времени термоциклере (Фостер Сити, Калифорния, США) в лаборатории молекулярной кардиологии, Института кардиологии Литвы, университета наук о здоровье. ПЦР в реальном времени проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл 1 универсальный MasterMix (Примененные биосистемы, город Фостер, Калифорния, США), 10,25 мкл воды (Ambion, Carlsbad, California , США), 1.25 мкл каждого Taqman зонда и 10-30 нг геномной ДНК в реакции. Гиперболизация была проведена в соответствии с протоколом поставщика проверенных зондов: 10 мин при 95 ° С, с последующими 40 циклами: 15 с при 95 ° С и 30 с при 60 ° С.

Статистический анализ: Данные по возрасту и холестерину, глюкозе, уровням креатинина были представлены как среднее значение Ã SD. Частоты генотипов представлены в процентах. Различия измеримых переменных между группами были проанализированы с помощью непарного студенческого Т-тест. Различия группирующих переменных, в том числе курение, гипертония, СД, нарушение функции левого желудочка (ЛЖ) (если фракция выброса ЛЖ <45¿), и мутации каждого генотипа, были проанализированы с помощью точного теста Фишера. Хи-квадрат анализ использовался для проверки отклонения распределений генотипов от равновесия Харди -Вайнберга и определения частоты аллелей или генотипов. Факторы риска, которые возникли, могли оказаться значимыми прогностическими (р<0,2) в множественной логистической регрессии. Модели пропорционального риска Кокса были применены для оценки последствий генетического полиморфизма и других клинических переменных в безрецидивной выживаемости. Были рассчитаны коэффициенты опасности (HR) и 95¿ доверительные интервалы (ДИ). Все статистические анализы были выполнены с использованием SPSS Advanced Statistics 10.0 для Windows. В этом исследовании значение P <0.05 было принято статистически значимым.

Результаты: Мы сравнивали контрольную группы и три подгруппы пациентов с ОКС ( нестабильная стенокардия, инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST и без подъема сегмента ST) по традиционным факторам риска ССЗ, включая АГ, СД, курение, уровень холестерина, ИМТ( таблица 1).

клиническая характеристика больных и волонтеров представлены в таблице 1. Большинство исследуемых – 50% составили пациенты с нестабильной стенокардией. Среди традиционных факторов риска наиболее частой была АГ – 71¿. Гиперлипидемия была наиболее выражена в группе больных с инфарктом миокарда подъемом сегмента ST. Наличие сахарного диабета и ожирения было отмечено соответственно у 15¿ и , индекс массы тела составил 27¿. На момент включения в исследование активными курильщиками были 32¿ пациентов и 31.9¿ волонтеров. В группе пациентов с ОКС наиболее часто встречалось одно и трех сосудистое поражение сосудов 44¿ и 43¿ соответственно (такое соотношение сохраняется и подгруппах ОКС). Всего было зарегистрировано 4¿ случая кровотечения(носовые кровотечения и желудочно - кишечные кровотечения). Крупных кровотечений зарегистрировано не было.

Молекулярно-генетическое исследование было выполнено у 72 пациентов, которые принимали двойную антиагрегантную терапию (ДАТ) и у 255 здоровых волонтеров. Результаты изучения полиморфизма генов, регулирующих обмен клопидогрела.

Полиморфизм CYP2C19 среди обследованного контингента больных казахской национальности было типичным для азиатской популяций, а у пациентов славянской национальности было типичным для европейской популяции. Большинство - 50(69.4¿) пациентов и 179(70¿) волонтеров оказались гомозиготами CYP2C19 *1/*1 «дикого типа». Гетерозиготными носителями аллелей *2, связанной со снижением активности, были 22(30.6¿) пациента и 71(27¿) волонтеров. Гомозиготный генотип CYP2C19 *2/*2 среди пациентов не встречался, а среди волонтеров составил 5(2¿) у лиц казахской национальности.

Носительство другого аллельного варианта CYP2C19 (*3 гетерозиготный аллель) у волонтеров и пациентов составило 18(7¿) и 5(7.2¿) соответственно. Редко встречаемый гомозиготный генотип CYP2C19 *3/*3 выявлен 6(2¿) волонтеров как казахской, так и славянской национальности.

Обсуждение: На сегодняшний день лечение клопидогрелем и резистентность к терапии больных с острым коронарным синдромом и после ЧКВ представляет собой серьезную проблему. Как выяснилось, у некоторых больных прием препарата не вызывает адекватного подавления реактивности тромбоцитов[12-13]. Эти больные, вероятно, являются менее защищенными от развития ишемических осложнений. Основная проблема, связанная с клопидогрелом, заключается в том, что он является пролекарством, которое в гепатоцитах превращается в активный метаболит под влиянием изоферментов цитохрома Р-450. Одним из основных изоферментов в этом процессе является CYP2C19 [13]. Ген CYP2C19 цитохрома P450, относится к семейству 2, подсемейству С, полипептид 19 и расположен в кластере генов цитохрома Р450 (CYP2C18- центромеры-CYP2C19-CYP2C9-CYP2C8-теломер) на хромосоме 10q23.33. Фермент CYP2C19 участвует в метаболизме большого количества клинически значимых препаратов, таких как антидепрессанты [14],бензодиазепины[15], мефенитоин [16], ингибиторы протонной помпы (ИПП) [17], а также пролекарства клопидогрел с антитагрегантной активностью [18]. Очевидно, что среди возможных причин лабораторной и клинической нечувствительности к клопидогрелу наибольшее значение имеют нарушения его обмена в системе CYP450. Показано, что у больных получающих клопидогрел в стандартной дозе, носительство определенных аллельных вариантов CYP450 со сниженной функциональной активностью ассоциируется с уменьшением концентрации активного метаболита препарата, меньшим подавлением функции тромбоцитов и более высокой частотой развития ССО, включая тромбозы стентов[19]. Такая зависимость продемонстрирована в первую очередь для аллелей низкой активности CYP2C19, частота носительства которых состовляет 25-30¿ у европеоидной и негроидной расы и 50-60¿ у представителей монголойдной расы[20]. Большая часть этих аллелей представлена CYP2C19*2 и CYP2C19*3. Другие аллели, ответственный за ослабленный метаболизм клопидогрела (CYP2C19*4, *5, *6, *7, *8) встречаются редко[21] и не имеют большого практического значения за исключением их носителей.

Наше сравнительное небольшое исследование, выполненное в казахской популяции, позволило выявить носительство CYP2C19*2 у 1/3 пациентов, что в целом соответствует азиатским показателям. Полученные результаты, касающиеся прогностической значимости носительства указанного аллельного варианта, также оказались сходными с результатами испытаний, выполненных в странах Кореи и Японии. Полученные результаты сопоставимы с данными, ранее зарегистрированными в других популяциях азиатского происхождения, но отличаются от наблюдаемых в африканских и кавказких популяциях. Сравнительные, результаты показали, что казахи, несут генетические варианты, подобные другим азиатам [22-23].

Особенность нашей работы заключается в том, что нами было впервые проведено фармакогенетическое исследование у больных получавших клопидогрел с ОКС/ЧКВ в Актюбинском регионе смешанного проживания лиц казахской и славянской национальности.

Выводы: Таким образом, около 30¿ пациентов с острым коронарным синдромом, проживающие в Актобе, являются «медленными метаболизаторами» и находятся под возможной угрозой возникновения новых сердечнососудистых катастроф в связи низкой чувствительностью к клопидогрелу. Этот факт диктует необходимость длительного, не менее 1 года, наблюдения за данными пациентами для оценки исходов их заболевания на фоне приема клопидогрела. Выше изложенные результаты демонстрируют высокую актуальность для региона проведения исследований, направленных на изучение прогностической значимости полиморфизма гена CYP2C19 у лиц, получающих клопидогрел, для оптимизации лечения таких пациентов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абсейтова С.Р. Острый коронарный синдром. Современные аспекты диагностики и лечения // Учебноепособие. Алматы: 2014. - 146 с.
2. Park DW, Park SW, Park KH, Lee BK, Kim YH, Lee CW, Hong MK, Kim JJ, Park SJ. Frequency of and risk factors for stent thrombosis after drug-eluting stent implantation during long-term follow-up// Am J Cardiol.- 2006.-№ 98.-P 352–356.
3. Mega J.L., Simon T., Anderson J.L, Bliden K., Collet J.-P., Danchin N., Giusti B., Gurbel P., Horne B.D., Kastrati A., Montalescot G., Neumann F.-J., Shen L., Sibbing D., Steg P.G., Trenk D., Wiviott S.D., Sabatine M. S. CYP2C19 Genetic Variants and Clinical Outcomes With Clopidogrel: A Collaborative Meta-Analysis (abst)// Circulation. – 2009.-№120. –Р 598-599.
4. Hulot, J.S. et al. CYP2C19 but not PON1 genetic variants influence clopidogrel pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical efficacy in postmyocardial infarction patients //Circ. Cardiovasc. Interv.-2011. -№4.-Р422–428.
5. Scott,S.A. et al.ClinicalPharmacogenetics Implementation Consortium. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for cytochrome P450-2C19 (CYP2C19) genotype and clopidogrel therapy // Clin. Pharmacol. Ther.2011. -№ 90. -Р 328–332.
6. Collet JP, Hulot JS, Anzaha G, Pena A, Chastre T, Caron C, et al. High doses of clopidogrel to overcome genetic resistance: the randomized crossover CLOVIS-2 (Clopidogrel and ResponseVariability Investigation Study 2) // JACC CardiovascInterv. -2011. -№ 4.-Р 392–402.
7. Aleil B., Leon C., Cazenave J.– P., Gachet C. CYP2C19*2 polymorphism is not the sole determinant of the response to clopidogrel: implications for its monitoring//J Thromb Haemost .-2009.-№ 7.-Р 1747–1749.
8. Simon, T. et al.; French Registry of Acute ST-Elevation and Non-ST-Elevation Myocardial Infarction (FAST-MI) Investigators. Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events // N. Engl. J. Med.- 2009.- № 360.-Р 363–375 .
9. Collaborative metaanalysis of randomized trials of antiplatelet therapy for prevention of death, myocardial infarction,and stroke in high risk patients.Antitrombotic Trialists´ Collaboration//BMJ.- 2002.-Р 71-86.
10. Ho PM, Maddox TM, Wang L, Fihn SD, Jesse RL, Peterson ED, Rumsfeld JS. Risk of adverse outcomes associated with concomitant use of clopidogrel and proton pump inhibitors following acute coronary syndrome // Jama. 2009. -№ 301.- Р. 937–944.
11. Shuldiner, A.R. et al. Association of cytochrome P450 2C19 genotype with
12. the antiplatelet effect and clinical efficacy of clopidogrel therapy//JAMA.-2009. -№302,-Р849–857 .
13. Cytochrome P450 2C19 681G>A polymorphism and high on-clopidogrel platelet reactivity associated with adverse 1-year clinical outcome of elective percutaneous coronary intervention with drug-eluting or bare-metal stents / D. Trenk, W. Hochholzer, M.F. Fromm [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2008. -№ 20. – P. 1925–1934.
14. Giusti, B. et al. Relation of cytochrome P450 2C19 loss-of-functionpolymorphism to occurrence of drug-eluting coronary stent thrombosis. //Am.J. Cardiol.-2009.- №103.-Р 806–811.
15. Bouman, H.J. et al. Paraoxonase-1 is a major determinant of clopidogrel
16. Efficacy //Nat. Med.- 2011.-№17, -Р110–116 .
17. Zhao F, Wang J, Yang Y, Wang X, Shi R, Xu Z, et al. Effect of CYP2C19 genetic polymorphisms on the efficacy of proton pump inhibitor-based triple therapy for Helicobacter pylori eradication: a meta-analysis// Helicobacter.- 2008. -№16.-Р 532–541.
18. Sibbing, D. et al. Isolated and interactive impact of common CYP2C19 genetic variants on the antiplatelet effect of chronic clopidogrel therapy// J. Thromb.Haemost. -2010.-№8,-Р 1685–1693.
19. De Morais SM, Wilkinson GR, Blaisdell J, Meyer UA, Nakamura K, Goldstein JA. Identification of a new genetic defect responsible for the polymorphism of (S)-mephenytoin metabolism in Japanese. Mol Pharmacol. 1994; 46:594–598.
20. 18.Yu KS, Yim DS, Cho JY, Park SS, Park JY, Lee KH, et al. Effect of omeprazole on the pharmacokinetics of moclobemide according to the genetic polymorphism of CYP2C19//ClinPharmacol Ther. -2001.-№ 69.-Р 266–273.
21. Brandt JT, Close SL, Iturria SJ, Payne CD, Farid NA, Ernest CS 2nd, Lachno DR, Salazar D, Winters KJ. Common polymorphisms of CYP2C19 and CYP2C9 affect the pharmacokinetic and pharmacodynamic response to clopidogrel but not prasugrel //J.Thromb Haemost.- 2007.-№5. -Р 2429–2436.
22. C., Cuisset, T., Gaborit, B., Alessi, M.C. & Hulot, J.S. The CYP2C19*17 allele is associated with better platelet response to clopidogrel in patients admittedfor non-ST acute coronary syndrome// J. Thromb. Haemost.-2009. -№7. -Р 1409–1411.
23. Mega, J.L. et al. Cytochrome p-450 polymorphisms and response to clopidogrel// N. Engl. J. Med. - 2009. - №360. - Р 354–362.
24. 22. Hamdy SI, Hiratsuka M, Narahara K, El-Enany M, Moursi N, Ahmed MS, Mizugaki M Allele and genotype frequencies of polymorphic cytochromes P450 (CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1) and dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD) in the Egyptian population// Br J Clin Pharmacol.-2002.-№53. – Р.596–603.
25. 23.Kimura M, Ieiri I, Mamiya K, Urae A, Higuchi S. Genetic polymorphism of cytochrome P450s, CYP2C19, and CYP2C9 in a Japanese population//Ther Drug Monit.- 1998.- №20.-Р 243–247.