Кіріспе. Көру және жүйке жүйелерінің жұмысы жасушаішілік кальций концентрациясының өзгеруіне байланысты реттеледі, ол арқылы әртүрлі сигнал каскадтары іске қосылып, белгілі бір физиологиялық әсерлерге әкеледі. Бұл оқиғалардың әртүрлілігі нейрондық кальций сенсоры (НКС) тұқымдасының ақуыздарының әрекетінің нәтижесі болып табылады. Бұл тұқымдас өкілдерінің бірі-осы зерттеудің объектісіне айналған кальций байланыстыратын ақуыз рековерин. Кальций иондарымен байланысты рековерин фоторецептор жасушасының қараңғы фазасында родопсинкиназаны тежейді. Кальцийдің төмен концентрациясы кезінде жарық реакциясы кезінде ол родопсинкиназаны шығарады, ол өз кезегінде родопсин визуалды пигментін фосфорлайды, нәтижесінде визуалды трансдукция каскадының өшуіне алып келеді.
НКС тұқымдасының ақуыздарының экспрессиясы немесе жұмысындағы бұзылулар нейродегене- ративті және нейроофтальмологиялық аурулардың дамуына әкеледі. Соңғы жылдары тотығу стрессі аталған аурулардың патогенезінің маңызды факторларының бірі ретінде қарастырылады. Фоторецепторлы НКС тотығу кезінде олардың дисульфидті димеризациясы осы тұқымдас барлық ақуыздарында бір "жұпталмаған" консервативті цистеиннің арқасында пайда болуы мүмкін екендігі туралы бірқатар мәліметтер бар. Айта кету керек, адам рековерині өзінің амин қышқылы құрамында ірі қара мал бұқа рековериніне қарағанда цистеиннің екі қалдығы бар. Фоторецепторлы ретинальды қарқынды жарықтандыру кезінде фоторецепторлардың апоптозымен бірге жүретін бұқа мен адам өзендерінің димерлі және көп өлшемді формаларының жинақталуы байқалды [1]. Себебі, фоторецепторлар мен ретинальды пигментті эпителий жасушалары жарықтың әсерінен және оттегінің жоғары мөлшері жағдайында жұмыс істеуден үнемі тотығу зақымына ұшырайды.
НКС тұқымдасының ақуыздары рафт-құрылымдарында локализацияланғаны бұрын көрсетілген. Плазмалық мембрананың бұл аймақтары иондық емес жуғыш заттардың әсеріне төзімді және холестеринмен және сфинголипидтермен байытылған [2]. Кавеолин-1 әртүрлі сигналдық ақуыздарға қарсы тірек және реттеуші белсенділікке ие және рафт- құрылымдарының негізгі құрамдас бөлігі болып табылады. Дегенмен, оның фоторецепторлар жүйесіндегі рөлі әлі де белсенді түрде зерттелуде. Кавеолин-1 қызметі де осы ақуыздың Y14 қалдығында фосфорлануы арқылы тотығу стрессіне сезімтал. Реактивті оттегі түрлері кавеолин-1 экспрессиясына, ыдырауына, трансляциядан кейінгі модификацияларына және мембраналық тасымалдануына әсер етуі мүмкін. Әдебиеттерге сәйкес, рековерин кавеолин-1-мен әрекеттесу үшін жаңа серіктес ретінде танылғаны белгілі, бірақ бұл процесс тотығу зақымдану жағдайында қарастырылмаған [3]. Біз тотығу стрессі кавеолин-1 мен қалпына келтірудің өзара әрекеттесуіне және реттеуші белсенділігіне әсер етеді деп болжаймыз.
Материалдар мен әдістер
Ақуыз препараттарын алу. Рековериндердің миристоилденген рекомбинантты формаларының препараттары бұрын біз жасаған процедураны қолдана отырып алынды және шығарылды [3]. Кавеолин-1 (Cavy) жабайы түрінің N-шеткі фрагментінің рекомбинантты формалары және кавеолин-1 (CavE) фосфорланған формасына сәйкес келетін оның миметикасы біздің әдістемелерімізге сәйкес алынды және бөлінді [4].
Афинитті сорбенттегі ақуыздың тұнбасы. Рековериннің кавеолин-1-мен байланысуы сәйкесінше «pull-down assay» талдауымен анықталды. Адам мен ірі қара мал рековерин мономері мен димері (mRc және dRc) өндірушінің нұсқауларына сәйкес CavY кавеолин фрагменті және оның CavE миметикасымен тұндырылды, өндірушінің нұсқауларына сәйкес Sepharose CL-4B сорбентімен байланыстырылды [5]. Рековериннің әр формасынан (50 мкг) 30 мкл 75% инкубацияланды (об./ об.) бөлме температурасында 30 мин бойы cav1-101-сефароз суспензиясы (Eppendorf термомиксері, 1200 айн / мин) 20 мМ трис-HCl буферінде (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 2 мм MgCl2, құрамында 1 мМ CaCl2 немесе 2 мМ EGTA бар.
Инкубациядан кейін сорбентті 0.1% Tween-20 қосып, сол буферлермен үш рет шаяды. Байланысқан
ақуыздар белоктардың электрофорезіне сынамалар дайындау үшін бір реттік буфермен 20 мкл элюирленді және денатурациялық жағдайларда полиакриламидті гельде (ПААГ) электрофоретикалық талдау жүргізілді. Байланысқан ақуыз мөлшері GEL Analyzer 2010а бағдарламасының көмегімен денситометриялық түрде анықталды.
Аналитикалық процедуралар. Ақуыз препараттарының электрофорезі Лэмли әдісі бойынша [6] 12% немесе 15% ПААГ - да 10% Na-ДДС қатысуымен жүргізілді. Ерітінділердегі ақуыздардың концентрациясы Брэдфорд әдісімен анықталды [7].
Нәтижелері
Ақуызды-ақуыз өзара әрекеттесуін тексеру үшін аффинн сорбентте (Pull down assay) ақуыз преципитациялау әдісі қолданылды. Бұл әдіс зерттелген ақуыздар арасындағы өзара әрекеттесуді болжауға мүмкіндік береді.
Біз аффиндік сорбенттер алдық. Матрица ретінде Sepharose cl-4B сорбенті, алдын-ала белсендірілген BrCN болды, ол арқылы кавеолин-1 (CavY) N-терминалды фрагменттері бар амин топтары арқылы ковалентті түрде иммобилизацияланды және оның фосфорланған формасының мимикасы (CavE) (14 позициядағы тирозинді аминқышқылын фосфорланған күйге сәйкес келетін зарядты глутамин қышқылына ауыстыру). CavY кавеолиннің жабайы түрі-1-ге сәйкес келеді, ал CavE тотығу стрессінде жиі кездеседі.
Алынған сорбенттердің рекавериннің әртүрлі нысандарымен өзара әрекеттесуіне зерттеу жүргізілді. Тәжірибелерде жабайы типтегі протеинге сәйкес келетін қалпына келтірудің мономерлі формалары қолданылды, өйткені бұл көру жүйесінің қалыпты жұмыс істеуі үшін қажетті кең таралған формалар, тотығу стрессі кезінде торлы қабықта жиналатын ақуыздың үлгісі ретінде димерлі формалар қолданылады.
Жүргізілген эксперименттердің нәтижесінде біз CavY және CavE функционалды доменін қамтитын N-терминалды фрагменттердің sepharose CL-4B аффинн сорбентінде иммобилизацияланған мономермен және ірі қара мал мен адам рековеринінің димерімен жеткілікті тұрақты ақуыз кешенін құра отырып, жеке- жеке (in vivo кавеолиндері әдетте олигомерленуі мүмкін) екенін анықтадық. Преципитацияланған ақуыздарды жуу үшін қолданылатын буферде 0,1% Tween-20 иондық емес детергент болғандықтан, спецификалық емес байланыстарды бұғаттайды. Бұл детергентті қолдану аффинсіз ақуызды-ақуыздың өзара әрекеттесуінің қатаң шарты болды және жалған оң нәтижелерді барынша азайтты.
Сондай-ақ, фоторецептор жасушасының әр түрлі физиологиялық күйіне сәйкес келетін жағдайлар таңдалды (кальций иондарының болуы және болмауы жағдайында), онда мономер мен ірі қара мал мен адам өзендерінің димері кальций иондарының болмауы жағдайында CavY және CavE-мен қарқынды әрекеттескен, бұл осы процестің кальций сезімталдығын көрсетеді (сур. 1).
ҚОРЫТЫНДЫ
7 4
Зерттеулер нәтижесінде ірі қара мал және адам қалпына келтіру мономерінің және димерінің кавеолин-1 (M1-R101) N-терминалды фрагментімен өзара әрекеттесуі және кальцийдің жетіспеушілігінде қарқынды түрде орын алған оның фосфорланған түрінің мимикасы анықталды. иондары талданды. Реактиннің тотығуы оның тотықпаған түрімен салыстырғанда кавеолин-1-мен әрекеттесуін күшейтетіні көрсетілген. Ал тотығу стресі жағдайында ақуыздың фосфорлануын имитациялайтын кавеолин-1 Y14E мутациясы оның қалпына келтірудің кез келген түрімен әрекеттесуін әлсіретеді.
Бұл жұмыстың нәтижелері тотығу стрессі ақуыздарды өзара әрекеттесу ерекшелігі өзгеретінін көрсетеді, бұл визуалды жүйені реттеудің тотығу механизмдерімен байланысты болуы мүмкін.
Әдебиеттер
- Zernii E.Y., Nazipova A.A., Gancharova O.S., Kazakov A.S., Serebryakova M.V., Zinchenko D.V., Tikhomirova N.K., Senin I.I., Philippov P.P., Permyakov E.A. Permyakov S.E. Light-induced Disulfide Dimerization of Recoverin Under ex vivo and in vivo Conditions. Free Radic. Biol. Med. 2015. 83. 283–295.
- Giocondi M.C. Yamamotoc D., Lesniewskad E., Milhieta P.E., Andoc T., Grimelleca C.L. Surface topography of membrane domains // Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes. 2010. 1798. 703–71
- Vladimirov V.I., Baksheeva V.E., Mikhailova I.V., Ismailov R.G., Litus E.A., Nazipova A.A., Zamyatnin A.A. Jr., Permyakov S.E., Zernii E.Yu. Zinchenko D.V. A novel approach to bacterial expression and purification of myristoylated forms of neuronal calcium sensor proteins. Biomolecules. 2020. 10(7). 1025.
- Vladimirov V.I., Zernii E.Yu., Baksheeva V.E., Wimberg H., Kazakov A.S., Tikhomirova N.K., Nemashkalova E.L., Mitkevich V.A., Zamyatnin A.A., Lipkin V.M., Philippov P.P., Permyakov S.E., Senin I.I., Koch K-W., Zinchenko D.V. Photoreceptor calcium sensor proteins in detergent-resistant membrane rafts are regulated via binding to Сaveolin-1. Cell Calcium. 2018. 73. 55-69.
- Kavran J.M., Leahy D.J. Coupling Antibody to Cyanogen Bromide-Activated Sepharose. Methods in Enzymology. 2014. 27–34.
- Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. 227(5259). 680–685.
- Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72(7). 248–254.