Пенициллинацилаза ферментін бөліп алудың технологиясын қүрастыру

АННОТАЦИЯ

Ферменттер сулы экстракция арқылы бактериялардан оңай алынатын белокты заттар болып табылады. Жасуша сыртының ферменттері бактериядан өте оңай алынады, ал жасуша ішілік ферменттердің алынуы жасуша қабырғасының өткізгіштік қабілетіне байланысты. Экстракция кезінде бактериялардың жасуша сырты ферменттерімен бірге экстрагентке басқа ерігіш заттарда өтеді, олар: амин қышқылдары, төмен молекулалы көмірсулар, түздар, қышқылдар және т.б.

Ішек тяқшасы Escherichia coli факультативті анаэробты, қоректі ортаға талғамсыз 37 0C - та және рН 7,2-7,4 болатын қарапайым қоректік орталарда жақсы өседі, сүйық ортада диффузды лайлану түрінде өседі және тығыз қоректік орталарда кәдімгі колониялар түзеді. Эшерихиоз диагноз қою үшін Эндо, Левин және т.б. дифференциалды диагностикалық орталар кең қолданылады.

Шикізат ретінде эшерихия колийді қолданамыз, себебі біріншіден, эшерихия колий басқа микроорганизмдермен салыстырғанда өзінен пенициллинацилаза ферментін үзіліссіз бөліп отырады, екіншіден, топырақ пен судың микробиологиялық көрсеткіші болып табылады, үшіншіден тоқ ішектегі қалыпты микрофлораның өкілі болып табылады. Етті пептонды сорпада өсірілген эшерихия колийден пенициллинацилазаны ферментін бөліп аламыз.

Кілт сөздер: Escherichia coli, фермент-пенициллинацилаза, экстракция әдісі,дифференциалды диагностикалық орталар, етті пептонды сорпа.

Жүмысгың мақсаты: Бактерия - эшерихия колийді өсіру, пенициллинацилаза ферментін бөліп алу.

Материалдар және әдістер.

Фильтрация бойынша шикізаттан өнімді бөліп алу, яғни бактерияның қабатындағы ферментті белгілі бір еріткіште ерітіп, кейін сүзу арқылы бөліп алу.

Нәтижесі мен сарапталуы.

Ағзада байқалатын барлық тіршілік белгілерін оның ішкі ортасында жүріп жатқан сан қилы реакциялардың тікілей нәтижесі деп қарауға болады. Бүл реакциялардың тіршілік қимылына сәйкес жылдамдықпен жүріп отыруы фермент арқылы жүзеге асады, яғни фермент дегеніміз организмдегі барлық химиялық реакциялардың жылдамдығын, бағытын және оның сипатын реттеп отыратын биологиялық катализатор. Алғашында фермент ашытқыдан алынғандықтан латын тіліндегі - fermentum ашытқы, fermentatio ашу деген сөзден шыққан. Фермент-субстратпен әрекеттескенде түтас молекуласымен емес, үшіншілік қүрылымындағы белгілі бір аймақ арқылы әрекеттесіп, сәйкес өзгерістерге келтіреді. Субстратпен әрекеттесетін осы бір шектелген аймақты ферменттің активті орталығы дейміз. Активті орталық арқылы фермент өз субстратын таниды және катализдейді. Ферменттің субстратын танитын бөлігін апофермент, ал катализдейтін бөлігін кофермент деп атайды. Халықаралық биохимия одағы (IUB) барлық ферменттерді үлкен алты класқа бөлуді үсынды. Қазіргі бар 2000-нан астам ферменттер сөзсіз осы алты класстың ішіндегі кез келген біреуіне жатады, теориялық жақтан айтқанда бүл алты класстың қүрамына кірмейтін ферменттің болуы мүмкін емес.

Ферменттердің классификациясы: оксиредуктазалар, транферазалар, гидролазалар, лиазалар, изомеразалар, лигазалар (синтетазалар).

Пенициллинацилаза гидралазалар классының пептидгидралазалар тобына жатады. Гидралазалар субстратты судың қатысуы арқылы ыдырататын ферменттер. Пептидгидразалазалар ақуызды әртүрлі пептидтік байланыстарды гидролиздейтін ферменттер. Пеницилинацилаза ферменті медицина саласында екі мақсатта қолданылады: 1) антибиотиктермен шақырылған аллергияда қолданылады; 2) табиғи пенициллиннен 6-аминопенициллан қышқылын (6-АПК) алу үшін қолданылады.

Escherichia coli тудыратын аурулар (эшерихиоздар). Энтералды және парентеральды эшерихиозды ажыратады. Энтералды көбінесе ас қорыту жолдарын зақымдайтын жедел жүқпалы аурулар, оның қоздырғыштары Е. coli-дің диарегенді штамдары болады. Парентералды кез келген мүшені зақымдаумен жүретін E.coli-дің шартты патогенді штамдарымен тудырлады. Ішек таяқшасын Т. Эшерих ашты (1885)

E.coli-дің маңызы. Ішек таяқшасы - бүл. тоқ ішектегі қалыпты микрофлорының өкілі; бірқатар пайдалы қызметтер атқарады, соның ішінде ішек ауруын тудыратын бактерияларға, шіріткіш бактерияларға, Candida туыстығындағы саңырауқүлақтарға антагонист болып келеді, В, Е, К тобындағы витаминдерді синтездеуге қатысады, клетчатканы жартылай ыдыратады. Тоқ ішекте 02, 07, 09 және т.б. серологиялық топтарға жататын E. coli мекендейді. E.coli ғылыми және тәжірибелік мақсаттарда кең қолданылады, ол генетикалық инженерия мен биотехнологияда кеңінен қолданылатын жан-жақты генетикалық үлгі, нысана; сонымен қатар, оны қоршаған орта нысандарының фекалды ластануын анықтау үшін санитарлық көрсеткіш микроорганизмі ретінде қолданылады. Дегенмен E. coli адам ағзасына зиян келтіруі мүмкін. Тоқ ішекте мекендейтін шартты патогенді штамдар ағзаның иммунды жүйесі әлсірегенде асқорыту жолынан тыс әртүрлі іріңді қабыну ауруларды тудыруы мүмкін (циститтер, отиттер, менингиттер, тіпті коли-сепсис). Бүл ауруларды парентералдық эшерихиоздар деп атайды.

Ферменттік белсенділік. E.coli жоғарғы ферменттік белсенділікке ие. E.coli сыртқы ортаның әсерінсіз өзінен үзіліссіз пенициллинацилаза фермент бөліп отырады. Ал басқа бактериялар (стрептококк, стафилакокк) тек сыртқы ортаның әсерінен ғана өзінен пенициллинацилазаны бөліп отырады.

Патогенді факторлары. E.coli энтеротропты, нейротропты, пирогенді әсер ететін эндотоксин түзеді (ЭПІТ тобы). ЭПІТ тобы ащы ішек эпителиіне жабысып немесе адсорбцияланып экзотоксинді түзеді, ол ащы ішек қуысында су мен хлоридтің мөлшерден көп бөлінуіне алып келеді және натрийдің кері сіңірілуін бүзады. нәтижесінде ішектің жиырылуын, іш өту мен сусыздануды күшейтеді. Кейбір диарегенді эшерихияларда дизентерия қоздырғыштары сияқты бактериялардың жасушаларға енуіне себепкер болатын инвазиялық факторлар анықталған. ЭПІТ ауру тудыруы нефротоксикалық әсерімен және қан кетумен де (геморрагия) анықталады. Патогенді факторларға адгезияға себепші болатын кірпікшелер (пили) мен ақуыздар және фагоцитозға кедергі жасайтын микрокапсула жатады. Шартты патогенді және диарегенді ішек таяқшалары антигенді қүрылымымен және патогенді факторлар жиынтығымен ерекшеленеді.

Энтералды эшерихиоздар әртүрлі болуы мүмкін симптомсыздықтан токсикалық септикалыққа дейін. Колиэнтериттер ерте балалар өлімінің себептерінің бірі болып табылады.

Иммунитеті. Аурудан соң иммунитет түрақсыз және үзақ емес.

Емдеуі. E.coli тудыратын ауруларды емдеу үшін антибиотиктер қолданылады.

Сақтандыру. Санитарлық гигиеналық іс шаралар жүргізу.

Дақылды өсіру. Ішек тяқшасы факультативті анаэробты. қоректі ортаға талғамсыз 37 0C - та және рН 7.2-7.4 болатын қарапайым қоректік орталарда жақсы өседі және тығыз қоректік орталарда колониялар түзеді.

Ферменттердің шикі заттан алынуы.

Ферменттер сулы экстракция арқылы бактериялардан оңай алынатын белокты заттар болып табылады. Жасушасыртының ферменттері бактериядан өте оңай алынады, ал жасуша ішілік ферменттердің алынуы жасуша қабырғасының өткізгіштік қабілетіне байланысты. Экстракция кезінде бактериялардың жасушасырты ферментерімен бірге экстрагентке басқа ерігіш заттарда өтеді, олар: аминқышқылдары, төмен малекулалы көмірсулар, түздар, қышқылдар және т.б. Егер микроорганизмнен алынатын қүрғақ затты 100 % деп есептесек, онда оның экстракция кезінде 2223 % еріткіштерге өтеді, ал ферменттердің 90-95 % алынады сондықтан 1 г қүрғақ заттың активтігі экстракциядан кейін 3,0-3,5 есеге артады. Жасушасыртылық ферменттердің экстракциясында әртүрлі әдістер қолданылады, біз бүл үрдісте фильтрация әдісін қолданамыз (1 - сурет).

Экстракция процесі кезінде судың балансын құру. Экстракцияға кеткен судың көлемін, бастапқы экстракцияға алынған судан қалдық суды алу арқылы табамыз. 2,5 дм3 су экстракция жасау үшін алсақ, одан 0,45 дм3 су қалса демек 2,05 дм3 су экстракциялауға кетті. Экстракция процесі біткеннен кейін әр перколятордан экстрагентті қүйып алып өлшейміз : біріншісінен 0,28 дм3, екіншісінен 0,29 дм3, үшіншісінен 0,30 дм3, экстрагент алынды. 0,28+0,29+0,30=0,87 дм3. ш.з жібітуге кеткен су. 2,05-0,87 дм3 = 1,18 дм3

Экстракция процесінде ш.з 22-23 % қүрғақ заты ерітіндіге өтеді. Егер ш.з ылғалы 10 % деп алсақ, онда 150 г қүрғақ заттын мөлшері 150-15=135 г. Қүрғақ заттың 23 % ерітіндіге өтті десек, онда перколяторда 135-31=104 г қүрғақ зат қалды.

Ферменттің активтілігін және әр перколятордағы экстракттың құрғақ затының мөлшерін анықтау.

Қүрғақ заттың мөлшерін анықтау үшін зерттелетін затты түрақты массаға жеткенше кептіреміз бірақ негізінен көп жағдайда қүрғақ заттың мөлшерін анықтау үшін рефрактометрия әдісі қолданылады. Ферменттің активтілігін анықтағанда протеолитикалық активтілігін анықтаймыз.

Фермент-пенициллинацилазаның активтілігін анықтау. Ферменттің концентрлі ерітіндісін және пенициллиннің жартылай аналогының түзын алып, тазартылған суда ерітеміз. Кейін стафилакоккус ауреус егілген қанды агардың алты жерінен тесеміз.

Үш тәуліктен кейін тәжірибеге алынған қанды агардың бірінші, екінші және үшінші тесігінде стафилакокктың колониясы өсіп түр, ал төртінші, бесінші және алтыншы тесігінде стафилакокктың колониясының өсуін пенициллин аналогының түзы тежеген. Демек, фермент - пенициллинацилаза активті болып шықты.

Тұжырымдар.

  1. Пенициллинацилаза ферментін алудың оптимальді технологиясы қүрастырылды. 2. Алынған заттың түрақтылығы анықталды. 3. Ферментативтік активтілігі табылды. 4. Алынған затқа сапалық спецификация қүрастырылды.

 

ӘДЕБИЕТТЕР

  1. Willey J. Prescott’s Principles of Microbiology /McGraw-Hill, 2009. - 968 p.
  2. Saghee, M.R., Sandle, T. and Tidswell, E.C. (Eds.) (2011): Microbiology and Sterility Assurance in Pharmaceuticals and Medical Devices, New Delhi : Business Horizons
  3. Безбородов А.М. Биотехнология продуктов микробного синтеза. Моногр. - М.: Агропромиздат,1991. - 238 с.
Жыл: 2014
Қала: Шымкент
Категория: Медицина