Аритмогендік синдромдарды таргетті секвенирлеуге арналған кітапханаларды дайындау ерекшеліктері

Мақалада Illumina платформасына арналған пайдаланушы кардиогенетикалық панелін пайдалана ‹›·ɪырыɪɪ, әртүрлі аритмогендік синдромдармен ассоциацияланған 96 генді таргетті байыту əдíсíмен таргетті секвенирлеу үшін ДНҚ кітапханаларын дайындаудың әдістемесі сипатталған. Таргетті гендердің ДНҚ кітапханалары әртүрлі аритмогендік синдромдары бар 65 науқасқа дайындалды. Хаттама 225 нг геномдық ДНҚ үлгілерінен ДНҚ кітапханаларын әзірлеуге оңтайландырылды. Бақылау ретінде p/n G9901C (Agilent Technologies, АҚШ) жиынтығымен бірге жеткізілген байытылған бақылау ДНҚ-сы (Enrichment Control DNA) пайдаланылды. Ең алдымен, барлық 65 науқастың ДНҚ үлгілері рестрикциялық ферменттер көмегімен әртүрлі фрагменттерге бөлінді жəне денатурация- ланды. Содан кейін, сақиналы ДНҚ молекулаларын құру үшін зондтар кітапханасы таргетті фрагменттерге гибридизацияланды. Келешекте биоинформатикалық талдау кезінде үлгілерді идентификациялау үшін 65 үлгіге әртүрлі 65 индекс сиквенстері қосылды. Зондтар биотинделді жəне таргетті фрагменттер магнитті стрептавидинді шарлар көмегімен бөлініп алынды. Кейін сақиналы ДНҚ молекулалары лигация үрдісі кезінде біріктірілді. Таргетті фрагменттер полимеразды тізбек реакциясы көмегімен амплификацияланды, нәтижесінде алынған индекстелген амплификация өнімдері Illumina HiSeq2000 жаңа буынды секвенаторында секвенирлеуге жіберілді.

Кіріспе

Жүрек ритмі зақымдануларының этиологиясын зерттеу өзектілігі ауру көрсеткіштері мен өлім көрсеткіштерінің жоғары болуымен жəне аритмиялар нәтижесінде кенеттен жүрек өлімінің дамуымен анықталады. Кенеттен жүрек өлімі (КЖӨ) заманауи кардиологияда шешілмеген маңызды мәселелердің бірі болып қалуда. Жыл сайын КЖӨ көптеген белсенді, еңбекке жарамды адамдар өмірін алып кетуде, қайтыс болғандардың 20 % жағдайында анық кардиологиялық аурулар болмаған [1-4]. КЖӨ себептері науқастың жасына байланысты әртүрлі болады. Мысалы, балаларда КЖӨ кенеттен өлім синдромы, белгілі жүрек аурулары (тіршілікке қауіпті жүрек ритмінің зақымданулары, кардиомиопатиялар, туа біткен жүрек кемістігі, бастапқы өкпе гипертензиясы, оң қарыншаның аритмогенді дисплазиясы жəне т.б.) түрінде сипатталған [5-7]. Ал ересек адамдарда КЖӨ даму механизмі көп жағдайда жүрек қарыншаларының өте жиі қысқартылуымен байланысты, кейбір жағдайларда брадиаритмиямен (жиі жүрек ритмі) жəне асистолиямен (жүректің тоқтауы) байланысты [8, 9]. 35 жастан төмен науқастарда басқа ишемиялық емес сипаттағы этиологиялардың әсері көрсетілген [10-13]. Жүрек ауруларынан қайтыс болған науқастардың көбісінде (80 %) жүректің ишемиялық ауруы (ЖИА) анықталды, сонымен қатар КЖӨ қауіпіне дилатациялық кардиомиопатия жəне жүрек ақауы бар қарт науқастар душар етеді [10]. КЖӨ гипертрофикалық кардиомиопатия [14-17], оң қарыншалы аритмогенді кардиомиопатия [5, 8], сонымен қатар Фалло тетрадасын радикалды түзетуден кейінгі қарт науқастарда [9], әсіресе сол қарынша дисфункциясы бар науқастарда кездеседі. Ал Бругада синдромы, туа біткен ұзартылған QT синдромы қарт науқастарда КЖӨ кезінде жиі кездесетін себептердің бірі болып табылмайды [18]. Кенет жүрек өлімінің дамуы 95 % жағдайда қарыншалық тахикардия мен қарыншалар фибрилляциясымен байланысты, ал қалған 5 % брадиаритмиялар мен асистолиялар үлесіне келеді [19-24].

Жаңа буынды жоғары өнімді секвенирлеу технологияларының дамуы аритмиялар дамуымен ассоциацияланған көптеген генетикалық вариацияларды зерттеуге мүмкіндік береді. Адам геномының толық ұзындығы 3,2 млрд жұп негізден тұрады, геномның ~1 % экзомды (ақуыз кодтайтын гендер) кодтайды, ол шамамен 30000 генді құрайды. Аритмиялардың >65 % анықтау үшін дәстүрлі диагностикалық тестілеуде 1-15 генді пайдалану əдетте жеткілікті.

Жаңа буынды секвенирлеу генетика саласында зертханаларда геномдар тізбектерінің вариация- сын тез жəне экономикалык тиімді жолмен аныктауға мүмкіндік береді. Жаңа буынды секвенирлеу көмегімен накты аурулармен байланысты генетикалык өзгерістерді аныктау үшін геномның накты таргетті аймактарын таңдап алу өте маңызды.

«Agilent Technologies» компаниясының гендер панельдері — накты косымшаларға арналған накты гендер жиынтығына шоғырланған күрылғылар. Алдын ала таңдалған контенті бар гендер панельдерін немесе жеке тапсырыс бойынша дайындалған гендер панельдерін сатып алуға болады. Алдын ала таңдалған таргетті гендер панельдерінің күрамына жарияланымдар мен сарапшы нүскауларынан таңдалып алынған маңызды гендер/ген аймактары кіреді. Аталған гендер панельдері ісік, түкымкуалайтын, жүрек-кантамыр ауруларын жəне аутизмді зерттеуге колжетімді. Ал пайдаланушы таргетті гендер панельдеріне зерттеушілер өздері накты зерттеу кызығушылыктарымен байланысты геном аймактарын таңдай алады. Пайдаланушы таргетті секвенирлеу белгілі бір жолдардағы немесе кең ауқымды геном зерттеулерінен (GWAS)ZronbiK геномды секвенирлеуден кейінгі ізденіс жүмыстарында гендерді зерттеуде колданылады.

Қазіргі кезде «Agilent Technologies» компаниясы алдын ала таңдалған контенті бар екі кардиогенетикалык панелін үсынады — HaloPlex кардиомиопатия (HaloPlex Cardiomyopathy) жəне HaloPlex аритмия (HaloPlex Arrhythmia). HaloPlex кардиомиопатия жəне HaloPlex аритмия панельдері жаңа буынды секвенирлеу платформаларында секвенирлеуге арналған таргетті тізбектерді байытатын гендер панельдері болып табылады. Аталған панельдер — сәйкесінше кардиомиопатия мен аритмиялардың тұкымқуалайтын формаларына арнайы әзірленген гендер панельдері.

Кардиомиопатиялар бойынша жарык көрген жариялынымдардың мүкият талдау мен NIH ғаламтор-ресурсындағы GeneReviews-тен алынған ақпараттан кейін HaloPlex кардиомиопатия панеліне гипертрофиялык кардиомиопатия, дилатациялык кардиомиопатия жəне оң карыншаның аритмогенді кардиомиопатиясымен байланысты 34 ген кіреді. HaloPlex аритмия панеліне үзартылған QT интервалының синдромы, кыска QT интервалының синдромы, Бругада синдромы жəне катехоламинергиялык полиморфты карыншалык тахикардиямен ассоциацияланған 21 ген кіреді. Кардиомиопатия мен аритмиялардың әртүрлі типтерімен байланысты кейбір гендерде айтарлықтай сәйкестік бар. Дәстүрлік Сэнгер бойынша гендерді секвенирлеумен салыстырғанда панельдер көмегімен клиникалык үлгілердің барлык гендерін бір уакытта жаңа буынды секвенирлеу платформасында бір экономикалык тиімді іске косуда секвенирлеуге болады [25, 26]. Бірак аталған зерттеу панельдері жүрек ритмінің зақымдалуына әкелетін барлық гендерді ескермейді. Сондықтан біз Медициналык зерттеулер орталығының (Австрия) кызметкерлерімен бірлесе отырып, аритмогендік синдромдармен ассоциацияланған 96 генді таргетті байыту әдісімен Таргетті секвенирлеуге арналған жаңа пайдаланушы кардиогенетикалык панелін SureDesign Online Design Software («Agilent Technologies») онлайн-бағдарламасы көмегімен әзірледік. Дайындалған панель қүрамына «Agilent Technologies» компаниясымен алдын ала әзірленген панельдер — HaloPlex Кардиомиопатия (HaloPlex Cardiomyopathy) жəне HaloPlex Аритмия (HaloPlex Arrhythmia) қүрамындағы сәйкесінше кардиомиопатия мен аритмиялардың тұкымқуалайтын формаларына жауап беретін 34 жəне 21 геннен басқа [27], әдебиеттік шолу жəне ESP6500, 1000 Genomes, HapMap т.с.с. мәліметтер базасы негізінде әртүрлі аритмогендік синдромдармен ассоциацияланған 41 ген кірді.

Жұмыстың мақсаты. Аритмогендік синдромдармен ассоциацияланған 96 геннен түратын әзір- ленген жаңа кардиогенетикалык панелі көмегімен аритмогендік синдромдары (атривентрикулярлык блокада, әлсіз синус түйін синдромы) бар 65 науқастың ДНҚ үлгілеріне HiSeq2000 платформасында секвенирлеуге арналған ДНҚ кітапханаларын дайындау.

Зерттеу материалдары мен әДістері

Ұлттык ғылыми кардиохирургиялык орталык базасында (Астана к.) зерттеу жүмыстары аясында генетикалық талдауға аритмогендік синдромдары (атривентрикулярлық блокада, әлсіз синус түйін синдромы) бар 65 наукас акпараттык келісім формасымен танысып, оған кол койғаннан кейін қатыстырылды. Әрбір науқастың клиникалық мәліметтері — диагнозы, ауру түрі, қосалқы аурулар, алып жатқан емі, емдеу нәтижелері, алынған терапия тарихы, эпидемиологиялық мәліметтері жəне т.б. жиналды.

Зерттеу хаттамасы, акпараттык келісім жəне рекрутингтің барлык түрлері Өмір туралы ғылымдар орталығының Жергілікті этикалык комитетінде (Назарбаев Университеті, Өмір туралы ғылымдар орталығының Этикалык комиссиясының 2015 жылғы 1 наурызындағы отырысыхаттамасының № 16 үзінді көшірмесі) жəне Ұлттық ғылыми кардиохирургиялық орталықтың Этикалық комитетінде (Этикалық комитеттің 2015 жылғы 24 ақпанындағы отырыс хаттамасының № 16 үзінді көшірмесі) қарастырылды.

Зерттеу объектілері — адамның геномдық ДНҚ-сы. Геномдық ДНҚ бөліп алу үшін мөлшері 9 мл ЭДТА бар арнайы зарарсыздандырылған вакунтейнер пробиркаларына (Venosafe) барлық зерттеуге қатысушылардың шынтақ көктамырынан көктамыр қаны алынды.

ДНҚ бөлу. Барлық 65 қан үлгісінен Wizard®Genomic DNA Purification kit (Promega) жиынтығының модификацияланған хаттамасы көмегімен геномдық ДНҚ үлгілері бөлінді. Бөлінген ДНҚ үлгілері сапалық (NanoDrop 2000 жəне 1,5 % агароздық гель) жəне сандық (Qubit 2000) əдíстермен сипатталды. Бөлінген ДНҚ-ң жалпы көлемі — 45 µl, 1 микролитрдегі ДНҚ концентра- циясы минимум 5 ng∕μl құрады.

Пайдаланушы кардиопанелін дайындау. Аритмогендік синдромдармен ассоциацияланған 96 генді таргетті байыту əдíсíмен Таргетті секвенирлеуге арналған жаңа пайдаланушы кардио- генетикалық панелі Грац қаласының Медицина университеті, Медициналық зерттеулер орталығының (Австрия) қызметкерлерімен бірлесе отырып, əзíрлендí (патентке өтініш берілді, 2017 жылдың 11 қазанындағы кіріс тіркеу нөмері № 25437). Кардиопанельді дайындауда SureDesign Online Design Software («Agilent Technologies») онлайн бағдарламасы қолданылды. Біз əзíрлеген панель құрамына «Agilent Technologies» компаниясымен алдын ала əзíрленген панельдер — HaloPlex Кардиомиопатия жəне HaloPlex Аритмия құрамындағы сəйкесíнше кардиомиопатия мен аритмиялардың тұқымқуалайтын формаларына жауап беретін 34 жəне 21 геннен басқа, əдебиеттíк шолу жəне ESP6500, 1000 Genomes, HapMap т.с.с. мəлíметтер базасы негізінде әртүрлі аритмиялармен ассоциацияланған 41 ген кірді. Пайдаланушы кардиопанель дизайні Illumina платформасына арналған Адам геномының 19 нұсқасы (Human Genome version 19 GRCh 37, February 2009) көмегімен құрылды, ридтер ұзындығы — 150 bp. Əзíрленген пайдаланушы панельді ILMFST, p/n G9901C каталогтық нөмері бойынша Agilent Technlogies компаниясының сайтынан əзíрлеушíлердщ рұқсатымен сатып алуға болады.

ДНҚ кітапханаларын құру. Таргетті гендер кітапханалары əзíрленген HaloPlex Custom Tier 1 kit, «Agilent Technologies» (ILMFST, p/n G9901C) жиынтығы көмегімен 10 кезеңнен тұратын «HaloPlex Target Enrichment System for Illumina Sequencing» (D.3 нұсқасы, желтоқсан 2012) хаттамасына сəйкес 65 ДНҚ үлгіге дайындалды. Хаттама 225 ng геномдық ДНҚ-ны қорытуға оңтайландырылған. Бақылау ретінде жиынтық құрамындағы байытылған бақылау ДНҚ (Enrichment Control DNA, ECD) пайдаланылды. Барлық 65 ДНҚ үлгілерінің сандық жəне сапалық талдауы сəйкесíнше Qubit 2.0 (Life Technologies, Сингапур) флуориметрі жəне 2 % агароздық гель көмегімен өткізілді. Таргетті гендер кітапханаларын дайындау екі түрлі аймақта өткізілді: ДНҚ үлгілерін байыту үрдісі преамплификация аймағында өткізілсе, амплификациялаған, байытылған ДНҚ үлгілерімен кейінгі тəжíрибелер пост- амплификациялық жұмыс аймағында орындалды.

Зерттеу нәтижелері жəне оларДы талДау

Зерттеуге қатысушыларДың клиникалық мәліметтері. Зерттеу жұмысына Ұлттық ғылыми кардиохирургиялық орталығында емделіп жатқан жүрек ритмінің зақымданулары бар (атривентри- кулярлық блокада, əлсíз синус түйін синдромы) 65 науқас кірді. Науқастардың жасы 4 пен 81 жас аралығында болды, олардың ішінде 16 науқастың жасы 18 жастан төмен болды. Ерлер мен əйелдердщ ара қатынасы сəйкесíнше 44,3 % жəне 55,7 % құрады. Науқастардың көбісінің ұлты қазақ — 70,1 %, орыстар — 13,4 %, басқа ұлттар — 16,5 %.

% науқастарға электркардиостимулятор имплантталды. Сол қарынша шығарылулары фракциясының орташа көрсеткіші — 61,2 %. Барлық науқастардың ішінде 96,9 % жағдайда жүрек өткізгіштігінің зақымдануларына тəн жиі жүрек соғу, əлсíздíк, ентігу, бас айналу, жүрек аймағындағы қақсау жəне т.б белгілер байқалды. 37,1 % науқастар анемнезінде синкоп немесе пресинкоп жағдайлары болды.

Зерттеуге қатысушылардың жанұялық анамнезі бойынша ақпаратты жинау барысында 25,8 % науқастың бір немесе екі ата-анасында жүрек қантамыр жүйесінің аурулары, атап айтқанда, артериалды гипертензия, жүректің ишемиялық ауруы, инсульт жəне т.б анықталды. Екі науқаста ата- аналарының біреуінде ритм немесе жүрек өткізгіштік (жүрекше фибрилляциясы, əлсíз синус түйін синдромы) зақымдануларының тұқымқуалаушылық формасы көрсетілген. Үш жағдайда науқастардың жанұя анемнезінде ата-аналарының біреуінде кенеттен жүрек өлімі тіркелген.

Әзірленген пайдаланушы кардиопанель көмегімен ДНҚ кітапханаларын әзірлеу. Зерттеу жұмысының нәтижесінде таргетті гендер кітапханалары аритмогендік синдромдармен ассоциация- ланған 96 генді секвенирлеуге арналған әзірленген пайдаланушы кардиогенетикалық панель көмегімен 65 ДНҚ үлгіге өндіруші хаттамасына сəйкес дайындалды.

Алғашқы кезеңде нуклеазалардан тазартылған 45 µl суда әрбір 225 ng геномдық ДНҚ үлгілері ерітілді, ДНҚ-ң ақырғы концентрациясы 5 ng/µì құрады. Содан кейін геномдық ДНҚ үлгілері сегіз әр түрлі рестрикциялық пробиркаларда 16 түрлі ферменттермен ұзындығы әртүрлі фрагменттерге 37 ºС температурада 30 мин ішінде кесілді. Жиынтықтағы байытылған бақылау ДНҚ (Enrichment Control DNA, Agilent Technologies, США) бақылау ретінде қолданылды, фрагментация нәтижелері 2100 Bioanalyzer биоанализаторында тексерілді.

Геномдық ДНҚ фрагменттерінің коллекциясы мен зондтардың гибридизациясы гибриди- зациялық мастер миксте 54 ºС температурада 3 сағат ішінде өткізілді. Гибридизациялық қоспа құрамына 50 µl гибридизациялық ерітінді мен 20 µl зонд кірді. Осы кезеңде ДНҚ сақиналы молекулаларын құру үшін зондтар кітапханасы таргетті фрагменттердің екі ұшына гибридизация- ланды. Сонымен қатар келешекте үлгілерді биоақпараттық талдау кезінде идентификациялау үшін гибридизация үрдісі кезінде 65 ДНҚ үлгісіне (таргетті аймақтарға) 65 түрлі индекс сиквенстері қосылды. Нәтижесінде, біз құрамына баркод (индекс сиквенстері) жəне сиквенс арнайы адапторлар кіретін таргетті ДНҚ-ң биотинделген циркуляцияланған фрагменттерін алдық.

Үшінші кезеңде құрамында биотин бар циркуляцияланған таргетті ДНҚ-зонд гибридтер магнитті стрептавидин шарларында ұсталды. Алдымен, магнитті шарлар 40 µl Capture solution ерітіндісінде ресуспензияланды жəне 160 µl гибридизациялық реакцияға қосылды. Содан кейін зондқа гибридизацияланбаған ДНҚ фрагменттерін жою үшін магнитті шарлармен байланысқан үлгілерді 100 µl Wash solution ерітіндісінде жудық жəне термоциклерде (Eppendorf, США) 46 ºС температурада 10 минут ішінде инкубацияладық. Сонымен қатар алтыншы кезеңде пайдаланылатын 10N NaOH концентрациясынан 50 mM NaOH ерітіндісін дайындадық.

Төртінші кезеңде таргетті ДНҚ-зондтар циркуляцияланған гибридтерді біріктіру үшін ұстау реакциясына ДНҚ-лигаза қосылды. Үлгілері бар пробиркалар термоциклерде 55 ºС температурада 10 минут ішінде лигациялау үшін инкубацияланды.

Бесінші кезеңде ұсталған таргетті ДНҚ амплификациясына арналған ПТР мастер миксін өндіруші (Agilent Technologies, США) хаттамасына сəйкес дайындадық. Келесі кезеңде элюция кезінде қолданылатын NaOH ерітіндісін нейтрализациялау үшін ПТР реакциясына 2М сірке қышқылын қостық.

Алтыншы кезеңде лигацияланбаған циркуляцияланған зонд-таргетті ДНҚ гибридтерін жою үшін ұсталған ДНҚ кітапханаларын 100 µl SSC Buffer ерітіндісінде жудық. Содан кейін ұсталған ДНҚ кітапханалары 25 µl жаңа дайындалған 50 mM NaOH ерітіндісінде элюирленді. Осы кезеңде жоғары сапалы NaOH ерітіндісін пайдалану ДНҚ-ны оңтайлы жуу жəне қалпына келтіруде өте маңызды болып табылады.

Келесі кезеңде ұсталған таргетті кітапханалардың ПТР-амплификациясы өткізілді. Яғни, 50 mM NaOH ерітіндісімен жуылған 20 µl ұсталған ДНҚ-ны 5-кезеңде дайындаған 30 µl ПТР мастер миксіне қостық. Ұсталған таргетті ДНҚ кітапханаларының ПТР-амплификациясы 60 ºС аннилинг температурасында өткізілді, циклдер саны — 20.

Сегізінші кезеңде амплификацияланған таргетті ДНҚ кітапханалары Agencourt AMPure XP (Beckman, США) шарлары көмегімен тазаланды. Алдымен, адаптерлер сияқты, кішкентай ДНҚ фрагменттерін жою үшін шарлардағы амплификацияланған таргетті ДНҚ кітапханаларын 70 % жаңа дайындалған этанолмен 4 рет жудық, содан кейін амплификацияланған таргетті кітапханаларды 10 mM Tris-HCl ерітіндісімен жуылды.

Тоғызыншы кезеңде ДНҚ кітапханаларының саны мен сапасы 2100 Bioanalyzer биоанализаторында (Agilent Technologies, США) бағаланды. Ампликондар ұзындығы 175–625 bp диапазонында болды, күтілгендей, өнімдердің көбісінің ұзындығы 225–525 bp құрады (сур. қара). Байытылған таргетті ДНҚ кітапханаларының сандық бағасын өткізу үшін ампликондардың 175–625 bp диапазонындағы мөлшері кірді. Дайындалған ДНҚ кітапханаларының орташа концентрациясы 90 ng/µì құрады.

Соңғы кезеңде əртурлî индекстері мен эквимолярлы саны (биоанализатор көмегімен алынған ДНҚ кітапханалардың концентрациясы) бар үлгілер HiSeq2000 платформасында мультиплексті секвинерлену үшін біріктірілді.

Қорыта келгенде, күрамына аритмогендік синдромдармен ассоциацияланған 96 ген кіретін таргетті секвенирлеуге арналған жаңа пайдаланушы кардиогенетикалык панелі көмегімен 65 ДНҚ кітапханалары дайындалды. Таргетті гендер кітапханаларын дайындау үшін, ең алдымен, ДНҚ үлгілері 16 түрлі рестрикциялык ферменттермен фрагменттерге бөлінді жəне денатурацияланды. Содан кейін сакиналы ДНҚ молекулаларын күру үшін зондтар кітапханасы таргетті фрагменттердің екі үшына гибридизацияланды. 65 индекс сиквенстері 65 үлгіге косылды. HaloPlex зондтар биотинделді жəне таргетті фрагменттер магнитті стрептавидинді шарлармен үсталды. ДНҚ сакиналы молекулалары лигация реакциясында біріктірілді. Кейін таргетті фрагменттер амплификацияланды. Нəтижесîнде, секвенирлеуге дайын байытылған жəне индекстелген амплификация өнімдері қүрылды. Барлык үлгілер HiSeq2000 жаңа буынды секвенирлеу платформасында секвенирленді. Қазіргі кезде алынған секвенирлеу мəлîметтершщ биоақпараттық талдауы өткізілуде.

Келешекте арнайы гендердегі мутацияларды бағалауды диагнозды түзетуде жəне емдеудің дербес əдîсшде пайдалануға болады. Зерттеу барысында табылған патологиялық мутациялар аныкталғаннан кейін, наукаска оның жакын туыстарының скринингі үсынылады. Алынған нəтижелер олардың жанүяларындағы кейінгі алдын алу іс-шараларды өзгертуі мүмкін.

Зерттеу жұмысы 2015–2017 жж. арналған ҚР БҒМ 0072/БТҚ «Қазақстанда геномдық медицина негіздерін құру жəне дамыту» бюджеттік бағдарламасы бойынша «Жүрек аритмияларына генетикалық бейімділікті анықтау жəне олардың диагностикасына арналған HaloPlex кардиогенетикалық панелін әзірлеу жəне клиникалық апробациялау» жобасы аясында өткізілді.

Əдебиеттер тізімі

1. Martin C.A. Recent developments in the management of patients at risk for sudden cardiac death / C.A. Martin, C.L. Huang,
2. D. Matthews // Postgraduate Medicine. — 2011. — No. 123(2). — P. 84-94.
3. Keating M.T. Molecular and cellular mechanisms of cardiac arrhythmias / M.T. Keating, M.c. Sanguinetti // cell. — 2001. Vol. 104. — P. 569–580.
4. corrado D. Sudden cardiac death in young people with apparently normal heart / D. corrado, c. Basso, G. Thiene // cardiovascular Research. — 2001. — Vol. 50. — P. 399–408.
5. Puranik R. Sudden death in the young / R. Puranik, c.K. chow, J.A. Duflou, M.J. Kilborn, M.A. McGuire // Heart Rhythm. 2005. — Vol. 2. — P. 1277–1282.
6. More D. Arrhythmogenic right ventricular dysplasia in the elderly / D. More, K. O'Brien, J. Shaw // Pacing clin. Electrophysiol. — 2002. — Vol. 25. — P. 1266–1269.
7. Aronow W.S. Prevalence and association of ventricular tachycardia and complex ventricular arrhythmias with new coronary events in older men and women with and without cardiovascular disease/ W.S. Aronow, c. Ahn, A.D. Mercando, S. Epstein, I. Kronzon // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. — 2002. — Vol. 57. — P. 78–80.
8. Maron B.J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review/ B.J. Maron // JAMA. — 2002. — Vol. 287. — P. 1308– 1320.
9. Thiene G. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia / G. Thiene, D. corrado, c.Basso // Orphanet J. Rare Dis. — 2007. — No. 2. — P. 45.
10. Ghai A. Left ventricular dysfunc-tion is a risk factor for sudden cardiac death in adults late after repair of tetralogy of Fallot /
11. Ghai, c. Silversides, L. Harris, G.D. Webb, S.c. Siu, J. Therrien // J. Am. coll. cardiol. — 2002. — Vol. 40. — P. 1675.
12. Roden D.M. American Heart Association. cardiovascular genetics and genomics / D.M. Roden. — chichester: Wiley- Blackwell, 2009.
13. Ho c.Y. Genetics and clinical destiny: Improving care in hypertrophic cardiomyopathy / c.Y. Ho // circulation. — 2010. — Vol. 122. — No. 2430 — P. 40.
14. Wang L. Narrative review: Harnessing molecular genetics for the diagnosis and management of hypertrophic cardiomyopathy / L. Wang, J.G. Seidman, c.E. Seidman // Ann. Intern. Med. — 2010. — Vol. 52. — No. 513. — P. 20.
15. Olivotto I. Myofilament protein gene mutation screening and outcome of patients with hypertrophic cardiomyopathy / I. Olivotto, F. Girolami, M.J. Ackerman et al. // Mayo clin. Proc. — 2008. — No. 83. — P. 80.
16. Bonora E. The metabolic syndrome is an independent predictor of cardiovascular disease in Type 2 diabetic subjects. Prospective data from the Verona diabetes complications study/ E. Bonora, G. Targher, F. Formentini et al. // Diabetic Med. — 2002. No. 21. — P. 52–58.
17. Pastors J.G. The evidence for the effectiveness of medical nutrition therapy in diabetes management / J.G. Pastors,
18. Warshaw, H. Daly et al. // Diabetes care. — 2002. — No. 25. — P. 608–613.
19. Sigal R.J. Physical activity/exercise and type 2 diabetes/ R.J. Sigal, G.P. Kenny, D.H. Wasserman et al. // Diabetes care. — 2004. — No. 27. — P. 25–39.
20. Franz M.J. Evidence based nutrition principles and recommendations for the treatment and prevention of diabetes and related complications / M.J. Franz, J.P. Bantle, c.A. Beebe et al. // Diabetes care. — 2002. — No. 25. — P. 148–298.
21. Marban E. cardiac channelopathies / E. Marban // Nature. — 2002. — Vol. 415. — P. 213–218.
22. Priori S.G. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia / S.G. Priori, c. Napolitano, N. Tiso, M. Memmi, G. Vignati, R. Bloise, V. Sorrentino, G.A. Danieli // circulation. — 2001. — Vol. 103. — P. 196–200.
23. Tiso N. Identification of mutations in the cardiac ryanodine receptor gene in families affected with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy type 2 (ARVD2) / N.Tiso, D.A. Stephan, A. Nava, A. Bagattin, J.M. Devaney, F. Stanchi, G. Larderet,
24. Brahmbhatt, K. Brown, B. Bauce, M. Muriago, c. Basso, G. Thiene, G.A. Danieli, A. Rampazzo // Hum Mol Genet. — 2001. — Vol. 10. — P. 189–194.
25. Splawski I. Spectrum of mutations in long-QT syndrome genes. KVLQT1, HERG, ScN5A, KcNE1, and KcNE2/
26. Splawski, J. Shen, K.W. Timothy, M.H. Lehmann, S. Priori, J.L. Robinson, A.J. Moss, P.J. Schwartz, J.A. Towbin, G.M. Vincent, M.T. Keating // circulation. — 2000. — Vol. 102. — P. 1178–1185.
27. chen Q. Genetic basis and molecular mechanism for idiopathic ventricular fibrillation / Q. chen, G.E. Kirsch, D. Zhang, R. Brugada, J. Brugada, P. Brugada, D. Potenza, A. Moya, M. Borggrefe, G. Breithardt et al. // Nature. — 1998. — Vol. 392. — P. 293–296.
28. Bauce B. Screening for ryanodine receptor type 2 mutations in families with effort-induced polymorphic ventricular arrhythmias and sudden death: early diagnosis of asymptomatic carriers / B. Bauce, A. Rampazzo, c. Basso, A. Bagattin, L. Daliento, N. Tiso, P. Turrini, G. Thiene, G.A. Danieli, A. Nava // J. Am. coll. cardiol. — 2002. — Vol. 40. — P. 341–349.
29. Laitinen P.J. Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia /P.J. Laitinen, K.M. Brown, K. Piippo, H. Swan, J.M. Devaney, B. Brahmbhatt, E.A. Donarum, M. Marino, N. Tiso, M. Viitasalo, L. Toivonen, D.A. Stephan, K. Kontula // circulation. — 2001. — Vol. 103. — P. 485–490.
30. Wilson K.D. A rapid, high quality, cost-effective, comprehensive and expandable targeted next generation sequencing assay for inherited heart disease / K.D. Wilson, P.Shen, E. Fung, I. Karakikes, A. Zhang, K. InanlooRahatloo, J. Odegaard, K. Sallam, R.W. Davis, G.K. Lui, E.A. Ashley, c. Scharfe, J.c. Wu // New methods in cardiovascular Biology. — 2015. — Vol. 117. — P. 603–611. doi: 10.1161/cIRcRESAHA.115.306723.
31. Green A. Assessment of HaloPlex amplification for sequence capture and massively parallel sequencing of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy associated genes/ A. Green, H. Green, M. Rehnberg, c. Svensson, c. Gunnarsson, J. Jonasson // The Journal of Molecular Diagnostics. — 2015. — Vol. 17. — P. 31–42. http:// dx.doi.org/10.1016/j.jmoldx.2014.09.006.
32. Retrieved from http://www.chem.agilent.com/library/datasheets/Public/HaloplexcardiomyopathyandArrhythmiaPanels DataSheet59912525EN.pdf.